Biosynthesis of bet-alanine in autolysosomes.

自溶酶体中 β-丙氨酸的生物合成。

• 批准号: 22K08681
• 负责人: 上野 隆
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: Juntendo University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K08681/
• 关键词: ピリミジン分解; ジヒドロウラシルデヒドロゲナーゼ; ウレイドプロピオナ－ゼ; β－アラニン; オートファジー; オートリソソーム; アミノ酸代謝; アミノ酸輸送

タンパク分解に由来しないアミノ酸であるβ－アラニンが肝臓のリソソームに多く貯留するメカニズムを明らかにするのが研究目的である。β－アラニンはウラシルから2段階の酵素反応（ジヒドロウラシルデヒドロゲナーゼおよびβウレイドプロピオナ－ゼ）で、それぞれジヒドロウラシル、ウレイドプロピオン酸（UPA）を経て生成する。先行する基盤研究C（課題番号18K08528）では、主として培養細胞を用いて前駆体であるウラシルやUPAを培地に加えてβ－アラニンの生成が増大するか、またβ－アラニンがリソソームに取り込まれるかの解析を試みた。しかし、そもそも48時間までの培養で細胞のβ－アラニンは高々20%程度が増える程度でコントロールと有意差も認められなかった。また、14C－β－アラニンを用いたリソソームへの輸送反応も今のところ捉えられていない。リソソームへのβ－アラニン輸送を調べる過程で、ジヒドロウラシルデヒドロゲナーゼとβウレイドプロピオナ－ゼは選択的オートファジー基質としてオートリソソームに取り込まれることを見出した。そこで本基盤研究ではオートリソソームに取り込まれたβ－アラニン生成酵素によってβ－アラニンが生成し、結果的に（オート）リソソームに貯留するという仮説の基に研究を開始した。研究初年度ではオートファジーを活性化させた条件下で培養細胞のβ－アラニンレベルが上昇し、逆にオートファジーを阻害する条件下では減少するかに焦点を絞って解析を試みた。まずβ－アラニンをより感度良く定量する方法としてcapillary-electrophoresis mass spectrometry（CE-MS）を導入し、まずウラシル、UPA、β－アラニンを分別検出する条件を確立した。次にオートファジーを誘導する条件や阻害する条件で細胞全体のβ－アラニンが変動するかを調べたが、今のところ上記仮説は支持されていない

本研究的目的是阐明β-丙氨酸（一种非蛋白水解产生的氨基酸）在肝脏溶酶体中大量积累的机制。 β-丙氨酸由尿嘧啶通过两步酶促反应（二氢尿嘧啶脱氢酶和 β-脲基丙酸酶）产生，分别将其转化为二氢尿嘧啶和脲基丙酸 (UPA)。在前面的基础研究C（课题号18K08528）中，我们主要利用培养细胞来研究在培养基中添加前体尿嘧啶和UPA是否会增加β-丙氨酸的产量，以及是否会吸收β-丙氨酸我试图分析。然而，当培养长达48小时时，细胞中的β-丙氨酸最多增加约20%，与对照没有观察到显着差异。此外，迄今为止尚未检测到使用14C-β-丙氨酸的溶酶体转运反应。在研究β-丙氨酸向溶酶体转运的过程中，我们发现二氢尿嘧啶脱氢酶和β-脲基丙酸酶作为选择性自噬底物被摄取到自溶酶体中。因此，本基础研究是基于这样的假设：β-丙氨酸是由β-丙氨酸生成酶被摄入自溶酶体中产生，并因此储存在（自）溶酶体中的假设。在研究的第一年，我们重点分析培养细胞中的β-丙氨酸水平是否在激活自噬的条件下增加，并在抑制自噬的条件下降低。首先，我们引入了毛细管电泳质谱（CE-MS）作为一种更灵敏地定量β-丙氨酸的方法，并首先建立了尿嘧啶、UPA和β-丙氨酸的差异检测条件。接下来，我们研究了在诱导或抑制自噬的条件下整个细胞中的β-丙氨酸水平是否发生变化，但到目前为止上述假设尚未得到支持。