Analysis of plasma kallikrein-dependent TGF-beta activation and liver fibrosis using the knock-in-mice

使用敲入小鼠分析血浆激肽释放酶依赖性 TGF-β 激活和肝纤维化

基本信息

批准号：
22K08067
负责人：
古谷裕
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Jikei University School of Medicine
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K08067/
关键词：
肝線維化肝がん TGF-β ノックインマウス血漿カリクレイン

项目摘要

TGF-βの活性化は肝線維化や肝がんの進行に関与しており、この活性化機構を解明することが重要である。我々は初期の肝線維化においてセリンプロテアーゼである血漿カリクレイン(PLK)によるTGF-β前駆体であるLAPの切断がTGF-β1の活性化を誘導することを見出している。しかしながらPLK依存的なTGF-β1活性化がどの様に肝線維化に関与しているのか明らかとなっていない。そこで当課題ではPLKによるLAP切断部位Arg58, Leu59に変異を導入し切断できない配列を持つノックインマウスをライン化し、肝線維化モデルを作製し、ノックインマウスと野生型マウスを比較することによりPLK依存的なTGF-β1活性化の役割を明らかにすることを目的として研究を行った。CRISPR/Cas9システムを用いて、TGF-β1 LAPの血漿カリクレイン切断サイトであるArg58, Leu59から、切断できないAla58, Ala59をコードする遺伝子配列に組換えたノックインマウスを作製し、変異の生殖系列への移行を確認した。このマウスのライン化を実施した。このTGF-β1ノックインマウスと野生型マウスを用いて胆管結紮による肝線維化モデルを作製し、胆管結紮（BDL）3日後と13日後に血漿中のALTとAST量とLAP-D量を測定した。肝切片を作製し、シリウスレッド染色を行い肝線維化領域を染色した。野生型マウスの血漿中ではBDL後13日目でLAP-Dの上昇が見られたが、ノックインマウスの血漿中で検出できなかった。また、血漿中のALT, ASTが野生型マウスと比較してノックインマウスではBDL後13日目で有意に抑制されたが、３日目では抑制されなかった。肝切片をシリウスレッド染色した結果、BDL後13日目で野生型マウスと比較してノックインマウスでは肝線維化が抑制される傾向があった。

TGF-β的激活参与肝纤维化和肝癌的进展，重要的是要阐明激活机理。我们发现，丝氨酸蛋白酶血浆kallikrein（PLK）裂解TGF-β前体膝盖会诱导TGF-β1在早期肝纤维化中的激活。但是，尚不清楚肝纤维化如何依赖PLK依赖性TGF-β1激活。因此，在这项研究中，我们进行了一项研究，目的是通过将突变引入PLK中的LAP裂解位点ARG58和LEU59，并使用敲入小鼠，并无法切割肝纤维化模型模型，并与Will-wild-ty-will-ty-wirt-will-tyce进行比较。使用CRISPR/CAS9系统，将敲入小鼠与编码ALA58和ALA59的基因序列重组，这些基因序列是TGF-β1圈的血浆kallikrein裂解位点，并将突变转移到种系中。这只鼠标被衬里。使用此TGF-β1敲入小鼠和野生型小鼠制备通过胆管连接的肝纤维化模型，在胆管连接后3和13天测量了血浆ALT，AST和LAP-D量（BDL）。准备肝切片，进行小天狼星红染色以染色肝纤维化区域。在BDL后13天，在野生型小鼠的血浆中观察到升高的LAP-D，但在敲入小鼠的血浆中未检测到它。此外，与野生型小鼠相比，BDL后第13天的敲门小鼠中的血浆ALT和AST受到显着抑制，但在第3天相比，由于肝脏截面的Sirius Red染色，与野生型小鼠相比，由于肝脏截面的Sirius Red染色，肝纤维化趋于抑制肝纤维化。