Analysis of plasma kallikrein-dependent TGF-beta activation and liver fibrosis using the knock-in-mice

使用敲入小鼠分析血浆激肽释放酶依赖性 TGF-β 激活和肝纤维化

基本信息

批准号：
22K08067
负责人：
古谷裕
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Jikei University School of Medicine
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K08067/
关键词：
肝線維化肝がん TGF-β ノックインマウス血漿カリクレイン

项目摘要

TGF-βの活性化は肝線維化や肝がんの進行に関与しており、この活性化機構を解明することが重要である。我々は初期の肝線維化においてセリンプロテアーゼである血漿カリクレイン(PLK)によるTGF-β前駆体であるLAPの切断がTGF-β1の活性化を誘導することを見出している。しかしながらPLK依存的なTGF-β1活性化がどの様に肝線維化に関与しているのか明らかとなっていない。そこで当課題ではPLKによるLAP切断部位Arg58, Leu59に変異を導入し切断できない配列を持つノックインマウスをライン化し、肝線維化モデルを作製し、ノックインマウスと野生型マウスを比較することによりPLK依存的なTGF-β1活性化の役割を明らかにすることを目的として研究を行った。CRISPR/Cas9システムを用いて、TGF-β1 LAPの血漿カリクレイン切断サイトであるArg58, Leu59から、切断できないAla58, Ala59をコードする遺伝子配列に組換えたノックインマウスを作製し、変異の生殖系列への移行を確認した。このマウスのライン化を実施した。このTGF-β1ノックインマウスと野生型マウスを用いて胆管結紮による肝線維化モデルを作製し、胆管結紮（BDL）3日後と13日後に血漿中のALTとAST量とLAP-D量を測定した。肝切片を作製し、シリウスレッド染色を行い肝線維化領域を染色した。野生型マウスの血漿中ではBDL後13日目でLAP-Dの上昇が見られたが、ノックインマウスの血漿中で検出できなかった。また、血漿中のALT, ASTが野生型マウスと比較してノックインマウスではBDL後13日目で有意に抑制されたが、３日目では抑制されなかった。肝切片をシリウスレッド染色した結果、BDL後13日目で野生型マウスと比較してノックインマウスでは肝線維化が抑制される傾向があった。

TGF-β的激活参与肝纤维化和肝癌的进展，阐明激活机制很重要。我们发现，丝氨酸蛋白酶（PLK）的割圈是一种受TGF-β保护的身体，会诱导早期肝纤维化中TGF-β1的激活。但是，尚不清楚肝纤维化如何依赖PLK依赖性TGF-β1激活。因此，在此任务中，PLK被引入圈切割位点ARG58和LEU59，而敲门式小鼠的尾流无法切割，创建肝纤维化模型，并比较了敲击-in小鼠和野生 - 键入PLK，我们进行了研究，以阐明TGF-β1激活的作用。使用crispr/cas9系统，来自arg58，leu59，这是一个质等离子体caricrain切割位点TGF-β1膝盖，通过调解Ala58和ala59的遗传序列，无法断开的遗传序列，而突变体是通过对敲击的小鼠进行的，而突变体为对变体的生殖会员证实了过渡。这只鼠标被排成一列。使用此TGF-β1敲入小鼠和野生小鼠创建了胆管结扎的肝纤维化模型，三天后和13天后测量了血浆中的Alt，AST量和LAP-D量。制作了肝脏碎片，并将肝纤维化区域染色为染料天狼星红。在野生型小鼠等离子体中，在BDL后的第13天看到了Lap-D的升高，但在敲入小鼠的血浆中无法检测到它。此外，与野生小鼠相比，在BDL后的第13天，血浆中的ALT和AST在敲击小鼠中被显着抑制，但在第三天没有抑制。由于肝切割的染色，敲击小鼠在BDL后的第13天倾向于抑制肝纤维化。