緑膿菌の病原性抑制薬の開発に向けたクオラムセンシング制御機構の基盤研究

群体感应控制机制开发铜绿假单胞菌致病性抑制剂的基础研究

基本信息

批准号：
22K07072
负责人：
老沼研一
金额：
$ 2.75万
依托单位：
Osaka Metropolitan University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

本研究では、緑膿菌の病原性抑制薬の開発に向け、本菌のクオラムセンシング(QS)（細胞密度検知機構）においてアシルホモセリンラクトン(AHL)レセプターとして機能するRhlRとQscRの作用機序の解析に取り組んでいる。以下にそれぞれの課題に関する研究実績の概要を記述する。1. RhlRの分子機能の解明RhlRは、極度に不安定であり、容易に凝集して失活するという特性を持つ。本研究の目的は、活性を有し安定で単離精製が可能な変異型RhlRを取得し、分子機能を解析することである。令和4年度は、N末端付近のαヘリックス内に存在する疎水性アミノ酸残基(Gly5, Gly6, Leu9, Gly13, Pro20)を、それぞれ親水性のアミノ酸（リジンもしくはアスパラギン酸）に置換した変異RhlRの発現系を構築した。大腸菌宿主細胞内で発現させ、可溶性画分への蓄積量をSDS-PAGEで確認した結果、Gly6とLeu9のアスパラギン酸への置換は、それぞれにRhlRの可溶性を高める効果があることが確かめられた。2. QscRの作用機序の解明に向けたPA1895-1897の機能解析QscRはQSの発動を抑制する働きを示すが、その作用はQscRの直接の支配下にあるPA1895, PA1896, PA1897の3遺伝子(PA1895-1897)の働きを介して生じることが判明している。PA1895-1897の具体的機能は未解明であるが、本研究代表者は、これらがコードしているのはAHLを分解または修飾する酵素であると推察している。令和4年度は、緑膿菌の無細胞抽出液に、QscRやPA1895-1897に依存的なAHLの分解・修飾活性があることを確認した。さらに、当該活性因子の細胞内局在性の解析に取り組んだ結果、無細胞抽出液中の成分を超遠心分離により可溶性画分と膜画分に分離すると、活性が不可逆的に失われることが判明した。

在这项研究中，我们正在研究RHR和QSCR的作用机理，这些作用机理在群体传感（QS）（QS）（细胞密度检测机理）中起作用为酰基羟瘤内酯（AHL）受体。下面描述了每个问题的研究结果的概述。 1。阐明RHLR RHLR的分子功能非常不稳定，并且具有易于聚集和停用的特性。这项研究的目的是获得活跃，稳定且能够分离和纯化的突变体RHL，并分析分子函数。在2022年，构建了突变rhR的表达系统，其中疏水氨基酸残基（Gly5，Gly6，Leu9，Gly9，Gly13，Pro20）存在于N端附近的α-螺旋中，用盐酸氨基酸（赖氨酸或天冬氨酸）代替。细胞在大肠杆菌宿主细胞中表达，可溶性部分中的积累量通过SDS-PAGE确认。已经证实，用天冬氨酸代替Gly6和Leu9具有增加RHR溶解度的作用。 2. PA1895-1897的功能分析以阐明QSCR QSR的作用机理具有抑制QS激活的函数，并且发现其效果通过PA1895，PA1896和PA1897的三个基因（PA1895-1897）的作用发现，并通过QSCR控制。 PA1895-1897的特定功能尚不清楚，但主要研究人员怀疑编码这些是降解或修改AHL的酶。在2022年，铜绿假单胞菌的无细胞提取物具有AHL降解和修饰活性，取决于QSCR和PA1895-1897。此外，由于分析了活性剂的亚细胞定位，发现无细胞提取物中的成分通过超速离心分离为可溶性馏分和膜分数时，该活性被非可逆地丢失。