感覚運動統合を制御する大脳皮質-高次視床核路の分子発生機構

控制感觉运动整合的大脑皮层-丘脑上核束的分子发育机制

• 批准号: 22K06242
• 负责人: 林 周一
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Kawasaki Medical School
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K06242/
• 关键词: 海馬; シナプス終末; 小胞放出; SBF-SEM; 大脳皮質; 視床

海馬における神経回路のシナプス形成の分子制御機構を明らかにするために、まず、子宮内電気穿孔法を用いて海馬のCA3領域に蛍光タンパク質を導入し、シナプス終末の形態を解析した。その結果、軸索で小胞放出を抑制したマウスでは、シナプス前終末と後終末の形態形成が阻害されることが分かった。このことは、シナプス前終末からの小胞放出がシナプス後終末の形態形成にも重要であることを示唆する。次に、蛍光顕微鏡で観察された形態異常の詳細を明らかにするために、Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM)を用いて、シナプス終末の3次元微細形態解析を行った。材料は上記と同様に、シナプス前終末からの小胞放出を抑制し、同時にその軸索を蛍光タンパク質で標識されるように遺伝子改変したマウスを用いた。成獣のホモ接合型と同腹のヘテロ接合型の各２匹を灌流固定し、取り出した脳をスライスした。その後、申請者がスイスのGraham Knott博士らと開発した光－電子顕微鏡相関法（MacLachlan et al., 2018）による観察を行った。まず、光学顕微鏡を用いて目印となる血管や細胞を撮影した。さらに、蛍光標識されたシナプス前終末の共焦点顕微鏡像を取得した。その後、生理学研究所において、スライスを電子顕微鏡観察用に染色し、樹脂包埋を行った。SBF-SEM観察では、血管や細胞体の位置を目印にして、事前に取得した蛍光顕微鏡像の領域を探し、30 nmごとの連続電子顕微鏡画像を取得した。その結果、小胞放出を抑制したマウスでは、シナプス終末形態が異常になることが分かった。

为了阐明海马神经回路中突触形成的分子控制机制，我们首先使用子宫内电穿孔将荧光蛋白引入海马CA3区并分析突触末端的形态。结果表明，在轴突中囊泡释放受到抑制的小鼠中，突触前和突触后末梢的形态发生受到抑制。这表明突触前末梢的囊泡释放对于突触后末梢的形态发生也很重要。接下来，为了阐明使用荧光显微镜观察到的形态异常的细节，我们使用串行块面扫描电子显微镜（SBF-SEM）对突触末端进行了三维微形态分析。使用的材料是经过基因改造的小鼠，可抑制突触前末梢释放囊泡，同时如上所述用荧光蛋白标记其轴突。通过灌注固定两只成年纯合动物和两只同窝杂合动物，并将取出的脑切片。随后，利用申请人与瑞士Graham Knott博士共同开发的光电子显微镜相关方法（MacLachlan et al., 2018）进行了观察。首先，他们使用光学显微镜拍摄血管和细胞等地标。此外，还获得了荧光标记的突触前末梢的共焦显微镜图像。此后，在国立生理科学研究所对切片进行染色以进行电子显微镜观察并包埋在树脂中。在SBF-SEM观察中，我们以血管和细胞体的位置为标志，在先前获取的荧光显微镜图像中搜索区域，并每30 nm获取连续的电子显微镜图像。结果表明，囊泡释放受到抑制的小鼠突触末端形态异常。