Analysis of regulatory mechanisms of stemness in human pluripotent stem cells

人多能干细胞干性调控机制分析

• 批准号: 22K06237
• 负责人: 樽本 雄介
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K06237/
• 关键词: ヒト多能性幹細胞; 遺伝子発現制御; 未分化性; 多能性幹細胞; 遺伝子発現; CRISPRスクリーニング

これまでにヒト多能性幹細胞の未分化性の維持に重要な転写調節因子Xを新たに同定し、未分化維持に重要な既知の転写因子であるPRDM14の機能的パートナーとしての役割をもつことを見出している。本研究ではより詳細な解析をおこなうため、まずヒトiPS細胞において、因子XあるいはPRDM14の改良型AID(Auxin-inducible degron)システムによる誘導分解系を組み込んだ細胞株をそれぞれ樹立した。誘導分解して6時間後の両者のクロマチン結合をChIP-qPCRで調べたところ、PRDM14分解時には因子Xのクロマチン結合がほぼ失われるのに対して、因子X分解時にはPRDM14の結合量は半分程度になっていた。これらの結果は、因子Xの結合がPRDM14に完全に依存していること、因子XがPRDM14の結合の安定化に重要であることを示唆しており、これまで因子XあるいはPRDM14のノックアウト細胞でみられた表現型の違い（発現が変化する遺伝子数や未分化マーカーの発現低下の時間）を説明すると考えられる。マウスES細胞では、因子XではなくそのホモログYがPRDM14の機能的パートナーであると報告されており、ヒトiPS細胞とは異なる。因子XとホモログYの機能の違いを検討するため、ホモログYを過剰発現したヒトiPS細胞で因子Xを誘導分解した。その結果、因子Xの欠損で引き起こされる遺伝子発現の変化が抑制され、未分化性の喪失も起こらなくなったことから、この実験系ではホモログYが因子Xの機能を代替可能であり、両者の機能的差異は検出されなかった。

迄今为止，我们已经有了新确定的转录调节剂X，这对于维持人类多能干细胞的未分化性质很重要，并发现它作为PRDM14的功能伙伴起作用，PRDM14是一种已知的转录因子，这是一种对维持未分化的性质重要的已知转录因子。在这项研究中，为了进行更详细的分析，我们首先在人IPS细胞中建立了细胞系，该细胞使用了因子X或PRDM14的改进的AID（生长素诱导的DEGRON）系统，该细胞结合了可诱导的降解系统。当诱导降解后通过CHIP-QPCR检查两者之间的染色质结合时，在PRDM14降解过程中，因子X的染色质结合几乎丢失，而PRDM14的结合量在执行因子X的降解时大约是一半。这些结果表明因子X结合完全取决于PRDM14，该因子X对于稳定PRDM14结合很重要，并且可以解释在因子X或PRDM14的基因敲除细胞中看到的表型差异（表达变化的基因数量和未分化标记的表达降低的时间）。在小鼠ES细胞中，据报道其同源性y（而不是因子x）是PRDM14的功能伙伴，该合作伙伴与人IPS细胞不同。为了研究因子X和同源物Y之间的功能差异，诱导因子X在过表达同源物Y的人IPS细胞中降解。结果，由于因子X的缺乏引起的基因表达的变化被抑制，并且不再发生不分化的丧失。因此，在这个实验系统中，同源物可以替代因子X的功能，并且两者之间未检测到功能差异。