Biological characterization of scorpion alpha/beta toxin like peptides in Japanese forest green tree frog

日本森林绿树蛙蝎子α/β毒素样肽的生物学特性

• 批准号: 22K05567
• 负责人: 稲垣 英利
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K05567/
• 关键词: モリアオガエル; 泡巣構成ペプチド; OTLP; 泡巣; ペプチド; イオンチャネル

今年度は、組換え技術及び化学合成でモリアオガエル泡巣の構成ペプチドOTLP（Oviduct Toxin-Like Peptide）の取得を試みた。モリアオガエル卵管RNAから４種類のOTLP cDNAをRT-PCRで単離し、大腸菌の発現ベクターpCold及びpGSTにサブクローニングして、OTLPペプチドの組換え体での発現を試みた。しかしながら、Cys残基の数が多いため正しい立体構造を形成することができず、機能的な発現には成功していない。酵母（Pichia pastoris）はCys残基の数が多いペプチドの発現にも多くの実績があるため、この発現ベクターpPICZにcDNAをサブクローニングして、培養液中に分泌させる形での組換え体の発現に取り組んでいる。OTLP1については化学合成による取得も目指している。OTLP1は66残基の長さをもつため、逐次延長法による合成は難しい。そこで、ペプチドを半分程度に分割して合成し、それらを縮合して全長ペプチドを得ることとした。本手法による合成の結果、全長ペプチドの生成が確認できた。しかしながら、縮合位置付近で副反応が多く見られたことから、縮合位置の再検討が必要であることが分かった。また、我々はOTLPの立体構造について、Cys残基の架橋様式の違うサソリ神経毒型とカエルプロテアーゼ・インヒビター型を当初、想定していた。どちらの立体構造が正しいかを検証するためにAlphaFold2を用いてOTLPの立体構造予測も行い、Cys残基の架橋様式についても検討している。

今年，我们尝试通过重组技术和化学合成获得林蛙泡沫巢的组成肽——输卵管毒素样肽（OTLP）。通过RT-PCR从Moria树蛙输卵管RNA中分离出四种类型的OTLP cDNA，亚克隆到大肠杆菌表达载体pCold和pGST中，并尝试以重组形式表达OTLP肽。但由于Cys残基数量较多，无法形成正确的三维结构，功能表达尚未成功。酵母（毕赤酵母）在表达含有大量Cys残基的肽方面拥有丰富的经验，因此我们将cDNA亚克隆到该表达载体pPICZ中，并通过将其分泌到培养基中来表达重组体。我们还计划通过化学合成获得OTLP1。由于OTLP1有66个残基长，因此很难通过顺序延伸来合成它。因此，我们决定通过将其分成大约一半并浓缩以获得全长肽来合成肽。使用该方法合成的结果，确认了全长肽的生成。然而，由于在缩合位置附近观察到许多副反应，因此发现有必要重新考虑缩合位置。此外，我们初步假设OTLP的三维结构为蝎子神经毒素型和青蛙蛋白酶抑制剂型，具有不同的Cys残基交联方式。为了验证哪种三维结构是正确的，我们还使用AlphaFold2预测了OTLP的三维结构，并且也在研究Cys残基的交联模式。