活性酸素種を量産する細胞質フラビン酵素が酸素に応答する現象・機構の解明

阐明大量产生活性氧的细胞质黄素酶对氧的反应现象和机制

• 批准号: 22K05436
• 负责人: 荒川 孝俊
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K05436/
• 关键词: 酵素; 活性酸素; 植物二次代謝; 活性酸素種; フラビン; 構造生物学; 生物無機化学

本研究では、ニンニクのクラスB型フラビン含有酸素添加酵素（BFMO）であるAsFMO1について生化学・生物生産・構造解析の諸実験を行ってBFMO活性を調節する因子を探し出すこと、触媒サイクルにおける複雑な中間状態を調査することを課題としている。本年度は酵素主反応であるアリイン生成活性、ならびにAsFMO1の活性発揮機序の探索を目的とする以下の実験を行った。１.アリイン合成を変動させる手段の探索に対しては、基質S-アリルシステインを添加してAsFMO1発現大腸菌を培養した細胞抽出液におけるアリインを調査した。酵素アリイナーゼ添加に応じたアリイン代謝物の検出は極微量であり、細胞内因子によるアリイン生成増強は観測されなかった。加えて、AsFMO1やAsFMO1とヒト肝臓ミクロソームで機能する哺乳類祖先型フラビンモノオキシゲナーゼAncFMO2を精製し、精製酵素に対して反応溶液中の溶存酸素濃度変化を電気化学測定により追跡した。その結果、NADPH添加に応じた酸素消費速度の増減は認められなかった。また、同一条件下でのNADPH消費活性と過酸化水素生成を呈色反応で計測したところ、AncFMO2のNADPH酸化能力はAsFMO1の約半分であり、AsFMO1, AncFMO2がNADPHの還元力を過酸化水素生成に転換する効率は20-25%程度であること、AncFMO2の活性酸素の生成能力はAsFMO1に対して40%程度であることがわかった。２.AsFMO1の活性発揮機序の探索に対しては、過酸化水素を含有させた反応液のAsFMO1反応時の過酸化水素濃度変化を計測した。生成／消費速度に変化はみられなかったことからAsFMO1はペルオキシダーゼ活性をもたず、過酸化水素を酸素から生成する方向にのみ触媒することが示された。

在这项研究中，B类B型黄素型氧气添加剂添加剂（BFMO）是一个复杂的催化循环，并探索生化，生物学生产和结构分析，以找到调节挑战活动的因素调查中间状态。今年，进行了以下实验，目的是探索酶主反应的ASFMO1活性机制和ASFMO1活性机制。 1。搜索用于波动ALIN合成的方法，将底物S-丙酰碱添加到Alin的Alin提取物中，其中AsfMO1表达大肠杆菌培养了。根据添加酶替代酶对Alin代谢产物的检测非常小，并且未观察到由于细胞内因子而导致的Alin产生增加。此外，对ASFMO1和ASFMO1和人肝微粒体功能的哺乳动物祖先一氧蛋白一氧化激酶ANCFMO2进行了完善，并通过电化学测量跟踪反应溶液中溶解的氧浓度。结果，氧气的消耗速度随着NADPH添加而增加或降低。另外，当在相同条件下使用NADPH消耗活性和过氧化氢的颜色反应测量时，ANCFMO2的NADPH氧化能力约为ASFMO1的一半，而ASFMO1和ANCFMO2的NADPH氧化能力使NADPH中的过氧化氢还原。转移到20-25％的效率，对于ASFMO1，产生ANCFMO2的活性氧的能力约为40％。 2。寻找theasfmo1活性的活性机理，测量反应溶液反应中氧化物浓度的变化含有过氧化氢。由于未看到发电 /消耗速度的变化，因此ASFMO1表明过氧化氢仅朝着产生过氧化氢的方向催化。