Directed evolution of sequence-regulationg polyhydroxyalkanoatae synthase for novel biopolyester biosynthesis

用于新型生物聚酯生物合成的序列调节聚羟基脂肪酸合酶的定向进化

• 批准号: 22K05422
• 负责人: 冨田 宏矢
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K05422/
• 关键词: ポリヒドロキシアルカン酸; 指向性進化; 生分解性プラスチック; 生合成

Error-prone PCR法によってランダム変異を導入したphaCAR変異遺伝子ライブラリーを作製し、これらを導入した大腸菌を3HHxを含む培地で培養した。PHAの合成量に応じて蛍光を発する蛍光色素ナイルレッドが含まれる培地で培養したところ、いくつかの変異体は親酵素よりも高い蛍光強度を示した。これらの変異体の変異点を同定した結果、N149D, F314L変異が見出され、これらの変異が3HHxの導入効率を高めていることが明らかとなった。続いて、F314に対して20種類全てのアミノ酸で一つずつ置き換えた飽和変異遺伝子ライブラリーを構築し、それぞれのポリマー合成量、3HHx導入率、モノマー配列を調べた。その結果、F314Hはいずれも高い結果を示し、3HB-3HHxからなるブロック共重合体を合成できることがわかった。さらにPhaCAR F314H変異体の組換えタンパク質を調製し、その酵素活性を調べたところ、3HHx-CoAに対して親酵素よりも高い酵素活性を示すことが明らかとなった。N149, F314をPhaCARのコンピュータ上での予想立体構造情報に当てはめたところ、F314はポリマー合成に直接関与する活性中心残基C315に隣接していた。そのため、F314への変異導入は基質選択に重要な役割を果たすことが示唆された。N149は活性中心からは離れたところに位置していたが、酵素活性に重要と思われるループ領域上のN396と相互作用していることが示唆された。この相互作用の変化が酵素の立体構造に影響を与え、その結果として基質特異性にも影響を与えた可能性がある。

使用易错PCR方法创建引入随机突变的phaCAR突变基因库，并将含有这些基因的大肠杆菌在含有3HHx的培养基中培养。当在含有尼罗红（一种荧光染料，根据 PHA 合成量发出荧光）的培养基中培养时，一些突变体表现出比亲本酶更高的荧光强度。鉴定这些突变体的突变点的结果，发现了N149D和F314L突变，并且表明这些突变提高了3HHx的导入效率。接下来，我们构建了将所有20个氨基酸一一替换为F314的饱和突变基因库，并检查了每个的聚合物合成量、3HHx引入率和单体序列。其结果，F314H均显示出良好的结果，可知可以合成由3HB-3HHx构成的嵌段共聚物。此外，当制备重组PhaCAR F314H突变蛋白并检查其酶活性时，发现其对3HHx-CoA表现出比亲本酶更高的酶活性。当N149和F314应用于计算机生成的预测的PhaCAR 3D结构信息时，发现F314与活性中心残基C315相邻，直接参与聚合物合成。因此，表明F314中引入突变在底物选择中起着重要作用。尽管 N149 远离活性中心，但有人认为它与环区域的 N396 相互作用，这被认为对酶活性很重要。这种相互作用的变化可能影响了酶的三维结构，从而影响了底物特异性。

项目成果

機能改変型ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素のモノマー配列制御の特性解析

功能修饰的聚羟基脂肪酸合酶单体序列控制的表征

• 发表时间: 2022
• 作者: 富士 航至;Phan Thi Hien;細江 有美; Guex Maureen;友居 昌慶;冨田 宏矢;Zinn Manfred;松本 謙一郎
• 通讯作者: 松本 謙一郎

ポリエステル合成酵素の機能改変による新規ブロック共重合体の生合成

通过聚酯合酶的功能修饰生物合成新型嵌段共聚物

• 发表时间: 2022
• 作者: 富士 航至;Phan Thi Hien;細江 有美; Guex Maureen;友居 昌慶;冨田 宏矢;Zinn Manfred;松本 謙一郎;冨田宏矢
• 通讯作者: 冨田宏矢

中鎖モノマー認識に向けたポリヒドロキシアルカン酸合成酵素の基質特異性の改変

修饰多羟基链烷酸合酶的底物特异性以识别中链单体

• 发表时间: 2022
• 作者: 向井 太一;Phan Thi Hien;冨田 宏矢;松本 謙一郎
• 通讯作者: 松本 謙一郎

Directed Evolution of Sequence-Regulating Polyhydroxyalkanoate Synthase to Synthesize a Medium-Chain-Length?Short-Chain-Length (MCL?SCL) Block Copolymer

序列调节聚羟基脂肪酸酯合成酶的定向进化合成中链长短链长（MCL？SCL）嵌段共聚物

• DOI: 10.1021/acs.biomac.1c01480
• 发表时间: 2022
• 期刊: Biomacromolecules
• 影响因子: 6.2
• 作者: Phan Hien Thi;Hosoe Yumi;Guex Maureen;Tomoi Masayoshi;Tomita Hiroya;Zinn Manfred;Matsumoto Ken’ichiro
• 通讯作者: Matsumoto Ken’ichiro

HES-SO Valais-Wallis(スイス)

HES-SO 瓦莱-瓦利斯（瑞士）