熱帯樹木由来高活性イソプレン合成酵素の探索とハイブリッド型発酵用高機能酵素の開発

寻找源自热带树木的高活性异戊二烯合酶并开发用于混合发酵的高性能酶

基本信息

批准号：
22K05195
负责人：
屋宏典
金额：
$ 2.66万
依托单位：
University of the Ryukyus
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

本研究では多様且つイソプレン合成が活発な熱帯植物のイソプレン合成酵素（IspS）を広範囲に探索し、高活性を実現する分子情報を解明し、非石油資源の発酵系に適したハイブリッド型高機能IspSの設計・開発を行うことを目的とする。R4年度は高活性、高基質親和性を可能とするIspSのコンセンサス配列の解明を行う計画であった。一般的に、優良酵素の探索には保存配列を標的にして目的の酵素の遺伝子クローニングを行い、組換え酵素を調製してその性質を解析する方法が用いられる。しかしながら、個々の樹木のIspSについて遺伝子クローニングを行い、組換え酵素の特性を解析する方法は多大の労力と時間を要し、広範な樹種の探索には適していない。これに対し、申請者が開発したPing Pong法は採取した切り枝の温度依存的なイソプレン放出を人工気象室内で測定するもので、わずか1日で温度応答性を評価することができ、極めて短期間で優良なIspSの供給源となる樹種の絞り込みが可能である。今年度はこれまでイソプレン放出測定が行われていない単子葉類に樹種範囲を拡大して、Ping Pong法でIspSの一次スクリーニングを行った。琉球大学構内にある12種の単子葉類のイソプレン放出の温度依存性を調べ、１０種（83％）がイソプレンを放出することを見出した。そのうち、ダンチクが最も高い温度依存性を示したので、IspSの遺伝子クローニングを試みた。IspSのコンセンサス配列を標的にしたRT-PCRにより、ダンチクIspSのコアー配列を得ることができた。ダンチク以外にミツヤヤシが特異な温度応答性を示したので、遺伝子クローニングの候補とした。次年度は、これらの樹種群のIspS遺伝子をクローニングして酵素学的特性を解析し、高機能酵素に特徴的なコンセンサスアミノ酸配列を明らかにする計画である。

这项研究旨在探索具有广泛活性异戊二烯合成的热带植物中的各种异戊二烯合酶（ISP），阐明了可实现高活性的分子信息，并设计和开发适合非高纤维基于基于 - 基质的发酵系统的混合高性能ISP。在R4财政年度中，该计划旨在阐明ISP的共识序列，该序列可实现高活性和高基质亲和力。通常，在寻找良好的酶时，使用一种方法，其中将靶酶的基因克隆靶向保守序列，并制备酶的性质，并分析酶的性质。但是，单个树木ISP的遗传克隆和表征重组酶的方法需要大量精力和时间，并且不适合寻找各种树种。相比之下，申请人开发的乒乓球方法衡量了温度依赖性的异戊二烯在人造天气室中收集的切割分支的释放，从而可以在短短一天内评估温度响应，从而使缩小树种在非常短的时间内用作优秀ISP的来源。今年，我们将树种范围扩展到单子叶植物，迄今为止尚未测量异戊二烯的释放，并使用Ping Pong方法对ISP进行了主要筛选。研究了位于Ryukyus大学内12个单尾物种中异戊二烯释放的温度依赖性，发现10种（83％）释放异戊二烯。其中，Danchiku显示出最高的温度依赖性，因此我们试图克隆ISP基因。 Danchik ISP的核心序列是通过针对ISP共有序列的RT-PCR获得的。除了Danchiku以外，Mitsuyas还表现出独特的温度响应能力，因此被用作基因克隆的候选者。明年，我们计划克隆这些树种的ISP基因并分析酶特性，从而揭示了高功能性酶的共识氨基酸序列。