光制御活性酸素負荷による間葉系幹細胞の運命決定技術の創製

创建利用光控活性氧负载来确定间充质干细胞命运的技术

基本信息

批准号：
22K04847
负责人：
原正之
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Osaka Metropolitan University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

再生医療分野で細胞移植治療や組織工学デバイスの作製に広く用いられる間葉系幹細胞（MSC）は、骨・軟骨・脂肪組織など多様な細胞に分化できる潜在的な能力を持つ組織幹細胞であり、増殖や分化を誘導する培養のために生理活性物質を添加する必要があるが、その生産性を高めるためには低コストで自動制御しやすい新たな増殖・分化誘導培養技術が求められる。本研究は3年間の研究計画に沿って、光増感色素（PS）の可視光照射で生じる低レベルの活性酸素種（ROS）を培養基材の表面からMSCに負荷しながら培養し、ROS負荷のタイミングや強さを変えて細胞の増殖や分化を誘導できる条件を探索することを目的とする。初年度の研究実績として、ROS負荷材料の作製に関しては、EDC/NHSを用いた架橋反応により、ヘマトポルフィリン（HP）修飾ガラス基板を作製した。この基板について、紫外可視吸収スペクトルを測定して、HPが固体化されていることを確認した。MSCの増殖、分化、概日リズムの解析に関しては、qRT-PCRの実験に用いるプローブの設計などの準備を行った。細胞内外のROS生成測定に関しては、光照射時のROS生成を定量する為、細胞外ROSの測定（p-nitrosodimethylaniline法）により、HP修飾基板よりROSが発生する事を確認した。また、ROS検出蛍光試薬 CM-H2DCFDAを使用して細胞内ROSの測定を行った。光照射後１～3時間程度の時間差を経て細胞内ROSのレベルが上昇する事を見出した。光照射装置の改良に関しては、複数の光照射条件を一度に処理する多チャンネル化への改良を施し、光照射装置の改良などを行った。

间充质干细胞（MSCs）是具有分化成骨、软骨、脂肪等多种细胞潜力的组织干细胞，广泛应用于再生医学领域的细胞移植治疗和组织工程装置的生产需要在培养中添加生理活性物质来诱导增殖和分化，但为了提高生产率，需要低成本且易于自动控制的新的增殖和分化诱导培养技术。根据三年的研究计划，这项研究的目的是培养间充质干细胞，同时将光敏染料（PS）从培养基表面照射可见光产生的低水平活性氧（ROS）负载到其中。是探索通过改变加载时间和强度来诱导细胞增殖和分化的条件。作为我们第一年研究的结果，关于 ROS 负载材料的生产，我们通过使用 EDC/NHS 的交联反应制造了血卟啉 (HP) 改性玻璃基板。测定该基板的紫外可见吸收光谱，确认HP固化。针对MSC增殖、分化、昼夜节律的分析，我们做了设计qRT-PCR实验探针等准备工作。关于细胞内外ROS产生的测量，为了量化光照射期间ROS的产生，我们通过测量细胞外ROS（对亚硝基二甲基苯胺法）确认了ROS是由HP修饰底物产生的。此外，使用ROS检测荧光试剂CM-H2DCFDA测量细胞内ROS。我们发现，光照射后约1至3小时的时间差后，细胞内ROS水平增加。关于光照射装置的改进，我们对光照射装置进行了改进，使其成为多通道，可以同时处理多种光照射条件。