直交的振動導入による表面上での酵素タンパク質の動的機能制御

通过引入正交振动对表面酶蛋白进行动态功能控制

• 批准号: 23510125
• 负责人: 川崎 剛美
• 金额: $ 3.66万
• 依托单位: Tokyo Institute of Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2011
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2011 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-23510125/
• 关键词: 酵素反応; 振動効果; パルス振動; 反射干渉分光法

本研究では、基質あるいは酵素自身を固定化した基板を、縦方向あるいは横方向に振動させ、その周波数や波形を操作することで、表面における酵素の反応性などを制御することを目指した。まずは、縦方向に振動する基板を用い、その基板上での反応性制御を、振動によって制御することを試みた。はじめに、表面における酵素反応活性の評価システムの構築を行った。はじめに、市販の圧電スピーカー素子に厚さ1mmの金属チタン板を導電接着した。この接着したチタン表面を陽極酸化し反射干渉分光法膜厚計測用の干渉層として機能する酸化チタン膜層を規定の厚さに形成させた。この厚み振動チップを用いて、表面における酵素反応を、基質タンパク質の表面に対する吸着、酵素の基質への結合、およびそれに引き続く基質の分解と酵素の脱離に伴う、表面結合タンパク質膜厚の変化として追跡する測定システムの構築をまず行った。このシステムを用い、圧電素子チップを様々なモードで振動させながら、複数の基質タンパク質とプロテアーゼの組み合わせで、振動モードに依存した酵素反応活性スペクトルを測定した。様々な検討の結果、作成した素子の共振周波数である10.85MHzで数百kHzの頻度でパルス振動させると、パルス頻度に応じて酵素活性が増大もしくは減少することがわかった。そこで、基質タンパク質として牛血清アルブミン(BSA)、カゼインを用い、プロテアーゼとしてサブチリシン、パパイン、サーモライシンを用いて、これらの基質と酵素の6個の組み合わせに関して、酵素活性における高周波縦振動(10.85MHz)のパルス振動効果(100kHz-900kHzの100kHz刻み)を調べた。その結果、基質と酵素の組み合わせで、その活性パルス効果のスペクトルが大きく変わることがわかった。例えばBSAを基質とした場合、サーモライシンを加水分解酵素として用いると、100-600kHzの範囲において2割程度の活性向上が認められ、さらに900-1000kHzの範囲では4割程度活性が向上した。これに対し、同じ基質にサブチリシンを作用させた場合では、いくつかの帯域で大きく活性が低下することがわかった。400kHzではその活性は半分程度になり、800-1000kHzの帯域ではその活性は4割程度にまで落ち込んだ。また、同じ酵素を用いても基質に応じてそのパルス効果スペクトルは変化した。生体の中では、多くの基質と酵素が混在している。以上今回得られた知見は、パルスをチューニングすることによって、複雑な反応系における特定の基質と酵素の組み合わせの活性を制御する方法論を提示する。このメカニズムは不明であるが、分子レベルでのこのようなパルス効果の研究はなく、新しい時代を開き得るものと期待できる。

在本研究中，我们的目的是通过在垂直或水平方向振动固定有底物或酶本身的底物并操纵频率和波形来控制表面上酶的反应性。首先，我们使用垂直振动的基板，并尝试通过振动来控制基板上的反应性。首先，我们构建了表面酶反应活性的评价体系。首先，将1mm厚的钛金属板导电接合至市售的压电扬声器元件。对接合的钛表面进行阳极氧化以形成具有特定厚度的氧化钛膜层，其充当使用反射干涉光谱法进行膜厚度测量的干涉层。使用这种厚度振动尖端，可以测量表面上的酶反应，因为由于底物蛋白吸附到表面、酶与底物结合以及随后的分解，表面结合蛋白膜的厚度发生变化。首先，我们构建了一个用于跟踪的测量系统。使用该系统，当以各种模式振动压电元件芯片时，我们根据底物蛋白质和蛋白酶的多种组合测量了取决于振动模式的酶反应活性谱。各种研究的结果发现，当以10.85MHz（所制造的装置的共振频率）数百kHz的频率对该装置施加脉冲时，酶活性根据脉冲频率而增加或减少。因此，使用牛血清白蛋白（BSA）和酪蛋白作为底物蛋白，枯草杆菌蛋白酶、木瓜蛋白酶和嗜热菌蛋白酶作为蛋白酶，我们研究了高频纵向振荡（10.85 MHz）对这些底物和酶的六种组合的酶活性的影响。研究了脉冲振动效应（100kHz-900kHz，增量为 100kHz）。结果发现，主动脉冲效应的光谱根据底物和酶的组合而发生很大变化。例如，当使用 BSA 作为底物并使用嗜热菌蛋白酶作为水解酶时，在 100-600kHz 范围内观察到活性增加了约 20%，在 900-1000kHz 范围内观察到活性增加了约 40%。另一方面，当枯草杆菌蛋白酶应用于相同的底物时，发现一些条带的活性显着降低。在400kHz时，其活性降低至一半左右，在800-1000kHz频段，其活性下降至约40%。此外，即使使用相同的酶，脉冲效应谱也会根据底物而变化。许多底物和酶共存于生物体中。这里获得的发现提出了一种通过调节脉冲来控制复杂反应系统中特定底物-酶组合的活性的方法。虽然这种机制尚不清楚，但目前还没有在分子水平上研究这种脉冲效应，我们可以期待这将开辟一个新时代。

项目成果

圧電素子表面におけるプロテアーゼ反応のパルス効果

压电元件表面蛋白酶反应的脉冲效应

• 发表时间: 2011
• 作者: 川崎剛美;岡畑恵雄
• 通讯作者: 岡畑恵雄