クライオ電子顕微鏡解析に基づく酵素―電極間直接電子移動制御型センサの開発

基于冷冻电镜分析的酶与电极直接电子传递控制型传感器的研制

基本信息

批准号：
21K18321
负责人：
浅野竜太郎
金额：
$ 16.64万
依托单位：
Tokyo University of Agriculture and Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Research (Pioneering)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-07-09 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

本研究は、汎用的な血中バイオマーカーの連続計測を可能とする酵素―電極間直接電子移動 (Direct Electron Transfer, DET) 制御型センサの開発を目的としている。具体的には、電極へのDET能を有するフラボシトクロムb2 (Fcb2)－シトクロム c (Cyt c) にそれぞれ抗体断片を融合させ、バイオマーカー依存的なDET効率の変化を測定原理とするセンサの開発を目指している。本年度は、主に1) Fcb2 とCyt cのクライオ電子顕微を用いた構造解析、と2) 構造情報に基づくFcb2 とCyt cへの抗体断片の融合、の観点から研究を進めた。1) Fcb2とCyt cのクライオ電子顕微鏡を用いた構造解析バイオマーカー依存的なDET効率の変化を測定原理とする新規センサの開発にはFcb2とCyt cの相互作用部位の特定が重要である。昨年に引き続き、それぞれ大腸菌発現系を用いて調製したFcb2とCyt cを量論的に混合させた後、クライオ電子顕微鏡解析を行った。結果、Fcb2の四量体構造を示す電顕像は得られたものの、Fcb2とCyt cの相互作用部位の特定には至らなかった。今後は、濃度比を変えて再測定する予定である。2) 構造情報に基づくFcb2 とCyt cへの抗体断片の融合クライオ電子顕微鏡を用いたFcb2 とCyt cの精密構造は得られていないが、既報の構造を基に、抗体断片を融合させるための連結モジュールの導入位置を決定した。それぞれ、連結モジュール融合分子を設計し、大腸菌発現系を用いて調製した。精製後の分子を用いて機能評価を行った結果、いずれも連結モジュール融合後もFcb2 とCyt cの本来の機能を保持していることが確認された。また、いずれも抗体断片との複合体化を行ったところ、高効率な複合体化、かつ抗体の機能を保持していることが確認された。

本研究的目的是开发一种酶电极直接电子转移（DET）控制的传感器，能够连续测量通用血液生物标志物。具体来说，我们将抗体片段与具有 DET 能力的黄素细胞色素 b2 (Fcb2) 和细胞色素 c (Cyt c) 融合到电极上，并开发一种以生物标志物依赖性 DET 效率变化作为测量原理的传感器。旨在今年，我们的研究主要集中在1）利用冷冻电镜对Fcb2和Cyt c进行结构分析，以及2）根据结构信息将抗体片段与Fcb2和Cyt c融合。 1) 使用冷冻电子显微镜对 Fcb2 和 Cyt c 进行结构分析 Fcb2 和 Cyt c 之间的相互作用位点的识别对于开发一种新的传感器非常重要，该传感器使用生物标志物依赖性的 DET 效率变化作为测量原理。继去年之后，Fcb2和Cyt c均使用大肠杆菌表达系统制备，按化学计量混合，然后进行冷冻电子显微镜分析。结果，虽然获得了显示Fcb2四聚体结构的电子显微镜图像，但无法鉴定Fcb2和Cyt c之间的相互作用位点。未来，我们计划改变浓度比并再次进行测量。 2）基于结构信息将抗体片段与Fcb2和Cyt c融合虽然利用冷冻电镜还没有获得Fcb2和Cyt c的精确结构，但是根据之前报道的结构，我们可以确定连接模块的安装位置已确定。分别使用大肠杆菌表达系统设计和制备了连接模块融合分子。使用纯化分子进行功能评估的结果证实，即使在与连接模块融合后，Fcb2和Cyt c仍保留其原始功能。此外，当与抗体片段进行复合时，证实两者都是高效复合物并且保留了抗体的功能。

项目成果

期刊论文数量（0）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

Crystal structure analysis of LanK complexed with landomycinA, a potent antitumor antibiotic

LanK 与兰霉素 A（一种有效的抗肿瘤抗生素）复合物的晶体结构分析

DOI：
发表时间：
2022
期刊：
影响因子：
0
作者：
Atsushi Tsugita;Shiro Uehara;Takashi Matsui;Takeshi Yokoyama;Iryna Ostash;Maksym Deneka;Subbarao Yalamanchili;Clay S. Bennett;Bohdan Ostash;and YoshikazuTanaka
通讯作者：
and YoshikazuTanaka

Exploration and application of DNA binding proteins as versatile tool for fabrication of biosensing elements

DNA结合蛋白作为生物传感元件制造通用工具的探索和应用

DOI：
发表时间：
2022
期刊：
影响因子：
0
作者：
Erika Komiya;Shouhei Takamatsu;Kaori Tsukakoshi;Wakako Tsugawa;Koji Sode;Kazunori Ikebukuro;and Ryutaro Asano
通讯作者：
and Ryutaro Asano

海洋天然物由来の新規生理活性タンパク質の構造機能解析

海洋天然产物中新型生物活性蛋白的结构和功能分析

DOI：
发表时间：
2021
期刊：
影响因子：
0
作者：
田中良和;影山大夢;辺ひろみ;増渕菜弥;中島寛也;小野寺かこ;大城拓未;松井崇;小寺義男;小川智久;横山武司;小松則夫;荒木真理人;酒井隆一
通讯作者：
酒井隆一

tRNA thiolation by TtuA-TtuB using [4Fe-4S] cluster

TtuA-TtuB 使用 [4Fe-4S] 簇进行 tRNA 硫醇化

DOI：
发表时间：
2022
期刊：
影响因子：
0
作者：
S. Yano;W. Suyotha;N. Oruro;T. Matsui;S. Shiga;T. Itoh;T. Hibi;Y. Tanaka;M. Wakayama;K. Makabe;田中良和;田中良和;田中良和;田中良和
通讯作者：
田中良和

Universal Design of Luciferase Fusion Proteins for Epigenetic Modifications Detection Based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer

基于生物发光共振能量转移的表观遗传修饰检测荧光素酶融合蛋白的通用设计