チロシンキナーゼ受容体Ｍｅｔによるシグナル伝達機構の構造的原理の解明

阐明酪氨酸激酶受体Met信号转导机制的结构原理

• 批准号: 18J12469
• 负责人: 中村 希
• 金额: $ 0.96万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2018
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2018-04-25 至 2020-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-18J12469/
• 关键词: X線結晶構造解析; シグナル伝達機構; 蛋白質間相互作用; 環状ペプチド; チロシンキナーゼ受容体; 細胞外

Metによるシグナル伝達機構の構造的原理の解明に向けて、Metの細胞外領域断片を多量に精製し、環状ペプチド(aMD4あるいはaMD5)との複合体結晶化することを計画していた。Metの細胞外領域はN末端からSema、PSIおよび4つのIPTドメインで構成されているが、環状ペプチドのMet結合部位は分かっていない。環状ペプチドの結合に関わらないドメインがないMet断片とペプチドの共結晶化を目指し、(1)Met細胞外領域をドメインごとに削った断片の調整および(2)ペプチドのおおまかな結合領域の探索の2点を行った。(1)Met細胞外領域断片の調整では、断片のC末端に付加するタグの検討を行った。Met細胞外領域の断片にHisタグを付加すると、IPTドメインを複数欠損した断片の発現が激減する。そこでC末端にヒト抗体IgG1由来のFcドメインを付加した。Fcの改良を行った末、全てMet断片で発現量と安定性が向上した。Fcが付加されたMet断片はProtein A セファロースによって単離でき、ゲル濾過法を組み合わせ高純度に精製する手法を確立した。(2)ペプチドの結合領域の探索では、ペプチドとの共結晶化に最適なMet断片を選ぶためにプルダウンアッセイ法によって結合実験をした。２種類のペプチドはMet細胞外領域全長や、C末端からIPTドメインを3つ削ったMet断片には結合できるが、すべてのIPTドメインを欠失した断片には結合できなかった。さらにSemaドメインも結合に必須であることも判明し、ペプチドとの共結晶化にはMet(Sema-PSI-IPT1)が必要最小の断片であること判断した。Metのアゴニストとして働く2量体ペプチドはMetのN末端側に結合することで、Metを活性型の2量体構造へ構造変化させキナーゼ領域の活性化が起こすことを示唆した興味深い結果である。

为了阐明Met信号转导机制的结构原理，我们计划纯化大量Met的胞外区片段，并与环肽（aMD4或aMD5）结晶复合物。 Met 的胞外区由 Sema、PSI 和 N 端的四个 IPT 结构域组成，但 Met 的环肽结合位点尚不清楚。为了使不具有不参与环肽结合的结构域的肽和Met片段共结晶，我们的目的是：(1)制备每个结构域均去除了Met细胞外区域的片段，以及(2)搜索肽的大致结合区域。 (1)为了制备Met胞外结构域片段，我们研究了添加到片段C末端的标签。在 Met 胞外区片段中添加 His 标签可显着降低缺乏多个 IPT 结构域的片段的表达。因此，在C末端添加了源自人抗体IgG1的Fc结构域。改进 Fc 后，所有 Met 片段的表达水平和稳定性均得到改善。添加了 Fc 的 Met 片段可以使用 Protein A Sepharose 进行分离，我们已经建立了一种通过与凝胶过滤相结合将其纯化至高纯度的方法。 (2)在寻找肽的结合区域时，采用pull-down分析方法进行结合实验，以选择最佳的Met片段与肽共结晶。这两种类型的肽能够结合全长Met胞外结构域和从C末端删除了三个IPT结构域的Met片段，但它们无法结合所有IPT结构域被删除的片段。此外，发现Sema结构域对于结合也是必需的，并且确定Met（Sema-PSI-IPT1）是与肽共结晶所需的最小片段。这是一个有趣的结果，表明充当 Met 激动剂的二聚肽与 Met 的 N 末端结合，导致 Met 的结构变化为活性二聚结构，从而导致激酶结构域的激活。

项目成果

貴夫, 酒井克也, 松本邦夫, 高木淳一 「ダイナミックな運動性をもつマルチドメイン蛋白質HGFの高難度結晶化の試み

Takao、Katsuya Sakai、Kunio Matsumoto、Junichi Takagi“尝试以高难度结晶 HGF，一种具有动态运动性的多结构域蛋白质”

• 发表时间: 2019
• 作者: 中村希;岩佐奈実;川上紗代子;有森貴夫;酒井克也;松本邦夫;高木淳一
• 通讯作者: 高木淳一

Signal-productive and unproductive Plexin B1 dimer conformations deduced by the binding modes of function-modulating cyclic peptides

由功能调节环肽的结合模式推导出信号产生和非产生信号的 Plexin B1 二聚体构象

• 发表时间: 2019
• 作者: 中村希;岩佐奈実;川上紗代子;有森貴夫;酒井克也;松本邦夫;高木淳一;中村希
• 通讯作者: 中村希