チロシンキナーゼ受容体Ｍｅｔによるシグナル伝達機構の構造的原理の解明

阐明酪氨酸激酶受体Met信号转导机制的结构原理

• 批准号: 18J12469
• 负责人: 中村 希
• 金额: $ 0.96万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2018
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2018-04-25 至 2020-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-18J12469/
• 关键词: X線結晶構造解析; シグナル伝達機構; 蛋白質間相互作用; 環状ペプチド; チロシンキナーゼ受容体; 細胞外

Metによるシグナル伝達機構の構造的原理の解明に向けて、Metの細胞外領域断片を多量に精製し、環状ペプチド(aMD4あるいはaMD5)との複合体結晶化することを計画していた。Metの細胞外領域はN末端からSema、PSIおよび4つのIPTドメインで構成されているが、環状ペプチドのMet結合部位は分かっていない。環状ペプチドの結合に関わらないドメインがないMet断片とペプチドの共結晶化を目指し、(1)Met細胞外領域をドメインごとに削った断片の調整および(2)ペプチドのおおまかな結合領域の探索の2点を行った。(1)Met細胞外領域断片の調整では、断片のC末端に付加するタグの検討を行った。Met細胞外領域の断片にHisタグを付加すると、IPTドメインを複数欠損した断片の発現が激減する。そこでC末端にヒト抗体IgG1由来のFcドメインを付加した。Fcの改良を行った末、全てMet断片で発現量と安定性が向上した。Fcが付加されたMet断片はProtein A セファロースによって単離でき、ゲル濾過法を組み合わせ高純度に精製する手法を確立した。(2)ペプチドの結合領域の探索では、ペプチドとの共結晶化に最適なMet断片を選ぶためにプルダウンアッセイ法によって結合実験をした。２種類のペプチドはMet細胞外領域全長や、C末端からIPTドメインを3つ削ったMet断片には結合できるが、すべてのIPTドメインを欠失した断片には結合できなかった。さらにSemaドメインも結合に必須であることも判明し、ペプチドとの共結晶化にはMet(Sema-PSI-IPT1)が必要最小の断片であること判断した。Metのアゴニストとして働く2量体ペプチドはMetのN末端側に結合することで、Metを活性型の2量体構造へ構造変化させキナーゼ領域の活性化が起こすことを示唆した興味深い結果である。

为了通过MET阐明信号转导机制的结构原理，我们计划纯化MET的大量细胞外区域片段，并用环状肽（AMD4或AMD5）结晶络合物。 MET的细胞外区域由N端的SEMA，PSI和四个IPT结构域组成，但是环状肽的MET结合位点尚不清楚。我们的目的是将MET片段和肽共结晶，而Met片段和肽无与环状肽的结合无关，并且（（1）调整为每个结构域切除细胞外MET区域的片段，以及（2）搜索肽的粗糙结合区域。 （1）在调整MET细胞外区域碎片时，我们研究了将其添加到片段的C端的标签。将其标签添加到细胞外MET区域的碎片中，大大降低了缺乏多个IPT域的片段的表达。因此，将源自人抗体IgG1得出的FC结构域添加到C末端。在改进了FC之后，所有符合片段都改善了表达水平和稳定性。可以通过蛋白A sepharose分离添加FC的MET片段，并使用凝胶过滤确定将其纯化为高纯度的方法。 （2）在搜索肽的结合区域时，使用下拉测定法进行结合实验，以选择与肽共结晶的最佳MET片段。两种类型的肽能够与整个MET细胞外区域的长度结合，并与从C末端移除的三个IPT结构域的MET片段结合，但无法与已删除所有IPT域的片段结合。此外，还发现SEMA结构域对于结合至关重要，并且确定MET（SEMA-PSI-IPT1）是与肽共结晶所需的最小片段。这是一个有趣的结果，表明充当MET的激动剂的二聚体与Met的N末端结合，转化为活性二聚体结构，从而导致激酶区域的激活。

项目成果

貴夫, 酒井克也, 松本邦夫, 高木淳一 「ダイナミックな運動性をもつマルチドメイン蛋白質HGFの高難度結晶化の試み

Takao、Katsuya Sakai、Kunio Matsumoto、Junichi Takagi“尝试以高难度结晶 HGF，一种具有动态运动性的多结构域蛋白质”

• 发表时间: 2019
• 作者: 中村希;岩佐奈実;川上紗代子;有森貴夫;酒井克也;松本邦夫;高木淳一
• 通讯作者: 高木淳一

Signal-productive and unproductive Plexin B1 dimer conformations deduced by the binding modes of function-modulating cyclic peptides

由功能调节环肽的结合模式推导出信号产生和非产生信号的 Plexin B1 二聚体构象

• 发表时间: 2019
• 作者: 中村希;岩佐奈実;川上紗代子;有森貴夫;酒井克也;松本邦夫;高木淳一;中村希
• 通讯作者: 中村希