多価不飽和脂肪酸合成酵素における生産性と生産物制御機構の解明

阐明多不饱和脂肪酸合成酶的生产力和产物控制机制

• 批准号: 18J10174
• 负责人: 林 祥平
• 金额: $ 0.96万
• 依托单位: Hokkaido University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2018
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2018-04-25 至 2020-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-18J10174/
• 关键词: 多価不飽和脂肪酸; 脂肪酸合成; 生合成; ポリケチド合成酵素; 多価不飽和脂肪酸; 脂肪酸合成; 生合成; ポリケチド合成酵素

本研究では、ドコサヘキサエン酸やエイコサペンタエン酸などの多価不飽和脂肪酸 (PUFA) の発酵生産系開発に向けた基盤研究として、多価不飽和脂肪酸合成酵素 (PUFA合成酵素) における生産性と生産物制御機構の解明に取り組んだ。前年度までの研究では生産物制御に関与する触媒ドメインβ-ketoacyl synthase/chain length factor (KS/CLF) を同定した。さらに、合成酵素を構成する各触媒ドメインと有機合成基質を用いたin vitro PUFA合成システムを再構築し、本解析系を用いてKS/CLFの機能と制御機構を明らかとした。そこで、本年度は詳細な制御機構を明らかにするため、(1)KS/CLFにおける生産物制御に関与するアミノ酸残基の同定、(2)KS/CLFの高次構造解析、(3)生産物のリリース機構の解明について検討を行った。(1)KS/CLFのマルチプルシーケンスアライメント及びPhyre2を用いたモデリングにより制御に重要なアミノ酸残基を絞り込んだ。候補残基をアミノ酸置換により変異させ、合成活性について大腸菌を用いたin vivo系で評価を行った。その結果、CLFの665番目のグルタミン酸及び、705番目のアルギニン残基の変異により生産物組成が変化したことから、これら残基が制御に重要であることがわかった。(2)KS及びCLFについて精製酵素を取得し、ゲル濾過クロマトグラフィーを用いて高次構造解析を行った。その結果、KSはCLFとヘテロ多量体を形成していることが示された。(3)合成酵素における生成物のリリース機構について大腸菌を用いたin vivo解析及び有機合成基質を用いたin vitro解析を行った。その結果、アシルトランスフェラーゼが生成物の加水分解反応を触媒し、生合成における最終ステップに関与することを明らかとした。

在这项研究中，我们致力于阐明多不饱和脂肪酸合酶（PUFA）作为旨在开发多不饱和脂肪酸合酶（PUFA合酶）发酵生产系统的基础研究的生产力和产品控制机制。直到上一年的研究确定了参与产品控制的催化域β-酮酰基合酶/链长度因子（KS/CLF）。此外，重建了使用每个构成合酶的催化结构域和有机合成底物的体外PUFA合成系统，并使用此分析系统揭示了KS/CLF的功能和控制机制。因此，为了澄清今年的详细控制机制，我们研究了（1）鉴定KS/CLF中涉及产品控制的氨基酸残基，（2）（2）分析KS/CLF的高阶结构，以及（3）阐明产品释放机制。 （1）通过KS/CLF的多个序列比对，并使用phyre2进行建模，对对照的氨基酸残基进行了范围。通过氨基酸取代突变候选残基，并使用大肠杆菌在体内评估合成活性。结果，由于位置665的谷氨酸突变以及在CLF的位置705的精氨酸残基而改变了生产成分，表明这些残基对对照很重要。 （2）对于KS和CLF获得了纯化的酶，并使用凝胶过滤色谱法进行了高阶结构分析。结果表明，KS形成了CLF的异聚物。 （3）使用大肠杆菌和使用有机合成底物进行体外分析的体内分析。结果表明，酰基转移酶会催化产品的水解反应，并参与生物合成的最后一步。