4D Imaging-based Analysis of Segregation Errors of individually labeled Chromosomes in Mouse Oocytes

基于 4D 成像的小鼠卵母细胞中单独标记染色体的分离错误分析

基本信息

批准号：
18J01017
负责人：
竹之内修
金额：
$ 2.33万
依托单位：
Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2018
资助国家：
日本
起止时间：
2018-04-25 至 2021-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

【CRISPR-Sirius構成タンパク質の精製】細胞内のCRISPR-Sirius構築タンパク質の存在量を安定させるため、厳密に管理された濃度の市販精製dCasを卵母細胞に打ち込んだ。結果、各染色体の標識効率が大きく改善された。次に、Hisタグカラムを用いて、複合タンパク質（sgRNA結合タンパク質と蛍光タンパク質）を大腸菌から精製し、卵母細胞へと導入した。結果、減数分裂の途中で染色体の一部が断片化してしまうことが判明した。精製の際に除去しきれなかった大腸菌由来の成分が、卵母細胞内の染色体のIntegrityに影響を与えていると考えられる。今後、精製タグを変更して再挑戦する。【染色体分配に影響を与えないイメージング条件の最適化】本研究では、3色の蛍光を同時に検出し、解析を行う。しかし、撮影条件は2色イメージングに最適化されている。3色イメージングを行う場合、励起光による卵母細胞へのダメージが懸念されたため、顕微鏡撮影の条件を最適化した。まず、全てのタイムポイント（3分おき）で、3色の蛍光タンパク質を励起・検出した結果、4割の卵母細胞が減数分裂を途中で停止してしまった（cond.1）。そこで、動態追跡に用いる1色（青）のみを3分おきに、染色体同定に用いる2色（赤と近赤）を30分おきに検出するように撮影条件を変更した。さらに、励起光を可能な限り減弱して撮影を行ったところ、イメージングによる減数分裂の停止を防ぐことができた（cond.2）。この条件において、8%の卵母細胞は減数分裂を途中で停止したが、イメージングを行わずにdish上で培養した場合においても1－2割程度の卵母細胞は減数分裂を途中で停止することが知られているため、イメージングによる影響ではないと考えられる。以上により、cond.2が3色イメージングに最適な実験条件であることを明らかにした。

CRISPR-SIRIUS组成蛋白的纯化：为了稳定细胞中CRISPR-SIRIUS组成蛋白的丰度，将卵母细胞植入严格控制的商业纯化的DCA中。结果，每个染色体的标签效率得到了极大的提高。接下来，使用His-Tag柱从大肠杆菌中纯化了复杂的蛋白（SGRNA结合蛋白和荧光蛋白），并引入卵母细胞。结果，发现部分染色体在减数分裂过程中变得分散。据信，在纯化过程中无法完全去除的大肠杆菌成分会影响卵母细胞内的染色体完整性。将来，我将通过更改炼油厂标签再次尝试。 [对不影响染色体分布的成像条件的优化]在这项研究中，同时检测和分析了三种荧光颜色。但是，成像条件是针对两色成像进行了优化的。进行三色成像时，人们担心会引起激发光引起的卵母细胞损伤，因此优化了微观成像的条件。首先，三种颜色的荧光蛋白是在所有时间点（每3分钟）的激发和检测，而40％的卵母细胞在中途停止了减数分裂（COND.1）。因此，更改了成像条件，以便每3分钟一次检测到一种用于动态跟踪的颜色（蓝色），每30分钟检测到两种用于染色体鉴定的颜色（红色和接近红色）。此外，当用激发光尽可能降低成像时，可以防止减数分裂被成像捕获（COND.2）。在这些条件下，有8％的卵母细胞在中间停止了减数分裂，但众所周知，即使在没有成像的菜肴上培养培养物时，大约10-20％的卵母细胞在中间停止了减数分裂，因此这似乎不是成像的效果。这表明COND.2是三色成像的最佳实验条件。