がん細胞転移を可視化するシステインプロテアーゼ蛍光プローブ

用于可视化癌细胞转移的半胱氨酸蛋白酶荧光探针

基本信息

批准号：
18F18116
负责人：
菊地和也
金额：
$ 1.47万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2018
资助国家：
日本
起止时间：
2018-04-25 至 2020-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本年度はタンパク質を超解像で解析するため、蛍光の点滅を1分子単位で取得するイメージング法を利用したタンパク質ラベル化プローブの開発に取り組んだ。具体的には、標的タンパク質にラベル化する時は蛍光を発し、解離すると蛍光を発しない可逆性のラベル化プローブを設計した。このプローブには、標的タンパク質に対して特異的かつ可逆に結合が起こること、ならびに結合時のみに蛍光を発することが求められる。融合発現可能なタグとして機能する標的タンパク質として、疎水性ポケットを有し、疎水性の匂い物質をリガンドとして可逆的に結合するOdorant Binding Protein (OBP)を選択した。リガンドとしては中程度のアルキル鎖長を有する脂肪酸を選択した。蛍光色素として、環境応答性を示す7-ジメチルアミノクマリン及びその誘導体を選択し、脂肪酸と連結しプローブを設計、合成した。OBPの組み換えタンパク質に対し、結合特性、蛍光特性を評価したところ、プローブを加えた際に蛍光強度の上昇が見られ、結合に伴い発蛍光性を有することが明らかとなった。またその結合定数はμM以上のオーダーであり、可逆的な結合に適した範囲の強さであることが分かった。また、リガンドおよびOBP配列の検討を行い、脂肪酸のアルキル鎖の最適化とOBPの結合ポケットにおけるアミノ酸変異によって結合時に20倍以上の蛍光上昇が観察された。このプローブを用いて生細胞におけるイメージングを行ったところ、細胞内局所に発現させたOBPをプローブにより迅速にラベル化できることが確認できた。さらに、洗浄操作によりプローブが解離し、蛍光シグナルが観察されなくなったことから、プローブが可逆的にタンパク質と結合し蛍光をスイッチさせることを示した。

今年，为了以超分辨率分析蛋白质，我们致力于使用成像方法开发蛋白质标记探针，该成像方法可以逐个分子地捕获闪烁荧光。具体来说，我们设计了一种可逆标记探针，当它标记在目标蛋白上时会发出荧光，但当它解离时不会发出荧光。该探针需要特异性且可逆地与靶蛋白结合，并且仅在结合时发射荧光。气味结合蛋白（OBP）具有疏水性口袋，作为配体可逆地结合疏水性气味剂，被选为目标蛋白，作为能够融合表达的标签。选择具有中等烷基链长度的脂肪酸作为配体。作为荧光染料，我们选择了具有环境响应性的7-二甲氨基香豆素及其衍生物，并通过将它们与脂肪酸连接来设计和合成探针。当评估重组OBP蛋白的结合和荧光特性时，当添加探针时观察到荧光强度增加，表明其在结合时表现出荧光。还发现结合常数约为μM或更高，这是适合可逆结合的强度范围。我们还检查了配体和 OBP 序列，发现通过优化 OBP 结合口袋中的脂肪酸烷基链和氨基酸突变，观察到结合后荧光增加了 20 倍以上。当我们使用该探针在活细胞中进行成像时，我们证实可以使用该探针快速标记细胞内局部表达的 OBP。此外，探针通过洗涤程序解离，并且没有观察到荧光信号，表明探针可逆地结合到蛋白质并转换荧光。