赤色光による細胞内シグナル伝達の制御手法の開発とシグナル動的変化の意義の解明

开发红光控制细胞内信号转导的方法并阐明信号动态变化的意义

• 批准号: 17J06739
• 负责人: 宇田 耀一
• 金额: $ 1.09万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2017
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2017-04-26 至 2019-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-17J06739/
• 关键词: 光遺伝学; オプトジェネティクス; 赤色光応答; Phycocyanobilin; Phtochrome B; シグナル制御; PhyB-PIFシステム; フィコシアノビリン

これまでの研究から生体反応においてシグナルの動的な変化に表現型の情報がコードされているという仮説が提案されている。この仮説を実証するため、赤色光に特異的に応答するPhyB-PIFシステムに着目した。PhyB-PIFシステムはPhyBとPIF と呼ばれるたんぱく質が赤色光によって二量体を形成するシステムである。また、遠赤色光によって二量体の解離を制御することが可能である。だが、PhyB-PIFシステムはPCBと呼ばれる色素が必要であった。そこで、本研究ではこの系をより汎用的に使えるよう改良し、シグナル伝達分子の活性の強度や周波数を再現性良く再構成することを目的として研究を進める。本年度は以下のように研究を実施した。１．PhyB-PIFシステムの改良前年度までに、シアノバクテリア由来のタンパク質群(PcyA, HO1, Fd, Fnr)を導入することで哺乳動物細胞内でPCBを産生させることに成功した。本年度は、さらに検討を重ね、FnrのN末端を切断しても機能に影響がないこと、また、N末端を切断したFnrとFdと融合させることでPCB産生のさらなる効率化に成功した。さらに、前年度にビリベルジン分解酵素(BVRa)がPCBを分解しており、BVRaのノックアウトによりPCB産生量が増加することを報告した。今年度はこの結果を踏まえ、より簡便にBVRaを抑制するためにvivo, vitroの両方においてBVRa阻害剤の探索を行った。２．細胞シグナルの制御PhyB-PIFシステムを用いてERKの活性を観察した。今年度はCRafのkinase domainを用いることでより少量の発現でERKの活性化を観察した。また、ホモ二量体化するシアノバクテリア由来Phytochrome (Cph)を用いてCRafを光依存的に凝集させ、１種類のタンパクの導入のみでERK活性の制御に成功した。

先前的研究提出了这样的假设：表型信息被编码在生物反应过程中信号的动态变化中。为了验证这一假设，我们重点研究了 PhyB-PIF 系统，它专门对红光做出反应。 PhyB-PIF 系统是 PhyB 和一种称为 PIF 的蛋白质在暴露于红光时形成二聚体的系统。还可以用远红光控制二聚体解离。然而，PhyB-PIF 系统需要一种称为 PCB 的染料。因此，在本研究中，我们的目标是改进该系统，使其能够更广泛地使用，并以良好的重现性重建信号转导分子的活性强度和频率。今年，我们进行了如下研究。 1.直到PhyB-PIF系统改进的前一年，我们通过引入一组源自蓝藻的蛋白质（PcyA、HO1、Fd、Fnr），成功在哺乳动物细胞中生产PCB。今年，我们进行了进一步的研究，发现切断Fnr的N端并不影响其功能，并且通过将Fnr与被Fd切断的N端融合，我们成功地使PCB生产变得更加高效。此外，我们在前一年报道称胆绿素降解酶（BVRa）可以降解 PCB，而敲除 BVRa 会增加 PCB 的产量。基于这些结果，今年我们在体内和体外寻找 BVRa 抑制剂，以更轻松地抑制 BVRa。 2.采用细胞信号控制PhyB-PIF系统观察ERK活性。今年，我们通过使用 CRaf 激酶结构域观察到较低表达水平的 ERK 激活。此外，通过使用同二聚化的蓝藻光敏色素（Cph）以光依赖性方式聚集CRaf，我们成功地通过仅引入一种类型的蛋白质来控制ERK活性。

项目成果

増大特集 細胞多様性解明に資する光技術─見て,動かす Ⅳ.狙ったものを動かす 光誘導性二量体化による細胞内シグナル伝達経路の操作

放大特色：有助于阐明细胞多样性的光学技术：观察和移动目标：通过光诱导二聚化操纵细胞内信号转导途径。

• DOI: 10.11477/mf.2425200710
• 发表时间: 2017
• 期刊: 生体の科学
• 作者: 青木一洋;宇田耀一;小田茂和
• 通讯作者: 小田茂和

赤色光を用いた光誘導性二量体化システムの開発と応用

红光光诱导二聚体系的开发与应用

• 发表时间: 2017
• 作者: 宇田耀一;松田道行;青木一洋
• 通讯作者: 青木一洋