放線菌由来新規ニトロ化酵素の同定と芳香族ジアミン生産系の開発

一种源自放线菌的新型硝化酶的鉴定及芳香二胺生产系统的开发

基本信息

批准号：
17J06071
负责人：
冨田宏矢
金额：
$ 2.58万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2017
资助国家：
日本
起止时间：
2017-04-26 至 2020-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

RufOの結晶構造解析で電子密度が観測されないループ部分に関する知見を得るため、共同研究による計算科学を用いてループ領域の挙動を予測し、酵素活性や基質認識に重要な役割を果たすアミノ酸残基の同定を試みることにした。すでに得られているX線結晶構造のデータをもとにMD計算、量子化学計算を行い、チロシンや一酸化窒素の結合のシミュレーションをマイクロ秒スケールで進めた。活性中心のヘム鉄は、ニトロ化反応が起こる状態と予想されるペルオキシナイトライトが配位したものを用いた。これまでの結果からは重要なアミノ酸残基の同定には至っていないものの、今後いくつかの変異体の作製およびその酵素活性の変化を併せて進めることで、酵素反応のメカニズムに迫ることができると考えられる。また、酵素学的に非常に珍しいニトロ化反応の反応機構に関する知見を得るため、ペルオキシナイトライトを用いた酵素反応試験を行った。一般的な水酸化反応を触媒するシトクロムP450酵素の場合、フェレドキシンから供給される電子を用いて分子状酸素を還元的に活性化するが、過酸化水素を用いることでフェレドキシン/フェレドキシン還元酵素および酸素を用いずにこの触媒サイクルをバイパスできることが知られる。そこでRufOによるニトロ化反応でも同様の反応が行えるかどうかを調べるため、本来の酵素反応に必要なフェレドキシン/フェレドキシン還元酵素と一酸化窒素の代わりにペルオキシナイトライトを加えて実験を行った。その結果、ペルオキシナイトライトでもニトロ化反応が進行することが明らかとなった。この結果は、ニトロ化反応を触媒するシトクロムP450酵素がペルオキシナイトライト中間体を経由するとの予想反応機構を支持するものと考えられる。

为了获得RufO晶体结构分析中没有观察到电子密度的环区域的知识，我们通过联合研究利用计算科学来预测环区域的行为，并分析了起重要作用的氨基酸残基我决定尝试识别它。基于已获得的X射线晶体结构数据进行MD计算和量子化学计算，并在微秒尺度上模拟酪氨酸和一氧化氮的结合。活性中心血红素铁被用于配位过氧亚硝酸盐，预计这是发生硝化反应的状态。尽管迄今为止的结果还没有导致重要氨基酸残基的鉴定，但我们相信，通过创建几个突变体并改变它们的酶活性，我们将能够更接近酶促反应的机制。此外，为了了解酶促硝化反应的反应机理，我们使用过氧亚硝酸盐进行了酶反应测试。在催化一般羟基化反应的细胞色素P450酶的情况下，由铁氧还蛋白提供的电子用于还原激活分子氧，但已知通过使用过氧化氢、铁氧还蛋白/铁氧还蛋白还原酶和氧，可以绕过该催化循环而不使用。因此，为了研究是否可以在使用RufO的硝化反应中进行类似的反应，我们进行了一项实验，其中添加过氧亚硝酸盐来代替原始酶促反应所需的铁氧还蛋白/铁氧还蛋白还原酶和一氧化氮。结果表明，硝化反应也在过亚硝酸盐中进行。这一结果似乎支持了预测的反应机制，其中催化硝化反应的细胞色素P450酶通过过氧亚硝酸盐中间体。