器官再生研究におけるモデル動物の高度化に必要なゲノム編集技術の開発

开发模型动物器官再生研究进步所需的基因组编辑技术

基本信息

批准号：
17J04796
负责人：
鈴木美有紀
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Hiroshima University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2017
资助国家：
日本
起止时间：
2017-04-26 至 2019-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本申請課題の最終年度となる平成30年度は、前年度に確立した高効率な遺伝子ノックアウトシステムを用いて、四肢再生に関与する遺伝子の機能解析を実施した。ソニックヘッジホッグ遺伝子(shh)は四肢発生において肢芽後方で発現し、肢の前後軸決定に重要な役割を果たす。四肢再生においても、shhの四肢エンハンサー(MFCS1/ZRS)を介したshhの再活性化が再生の鍵を握っていると考えられている。四肢再生におけるZRSの機能を明らかにするため、前年度に確立した高効率な遺伝子ノックアウトシステムを用いて、ZRSへの変異導入を行ったところ、わずか数塩基の変異により四肢再生が阻害されることを示した。この成果は、有尾両生類において特定のシス制御配列が再生能力に深く関与していることを示した初めての報告である。変異が導入されていた部位は四肢再生に重要と考えられている転写制御因子Xの結合配列であった。さらにZRS変異体では再生芽をまったく形成しないというシビアな表現型も見られており、前後軸決定だけではなく四肢再生そのものにも重要である可能性が示唆された。ZRSの機能解析では当初の予想を超えた興味深い結果が得られたため、オミックス解析により明らかとなった四肢再生芽で発現する分子の機能解析には至らなかったが、有尾両生類の再生メカニズムに迫りうる重要な知見を得ることができた。また、イベリアトゲイモリにおけるsafe harbor siteの同定にも成功した。この領域に、当研究室で開発したノックイン技術PITCh法を用いて、ヒストンH3のアセチル化修飾動態を解析できるプローブ(Mintbody)配列を挿入したイモリの作出を試みた。トランスジェニックイモリはMintbodyの特徴である核特異的な蛍光を全身で長期間(3ヵ月以上)安定して示し、ゲノム編集技術を用いた個体レベルの遺伝子機能解析システム構築の見込みが立った。今後はF1の作出をすすめ、生殖細胞系列への伝達を確認する予定である。

2018财年，即该应用项目的最后一年，我们利用前一年建立的高效基因敲除系统，对肢体再生相关基因进行了功能分析。 Sonic Hedgehog基因（shh）在肢体发育过程中在肢芽后部表达，在决定肢体前后轴方面发挥重要作用。在肢体再生中，通过 shh 肢体增强子（MFCS1/ZRS）重新激活 shh 被认为是肢体再生的关键。为了阐明ZRS在肢体再生中的功能，我们利用去年建立的高效基因敲除系统向ZRS引入突变，结果发现仅少数碱基的突变就抑制了肢体再生。该结果是第一份表明特定顺式调控序列与尿指两栖动物的再生能力密切相关的报告。引入突变的位点是转录调节因子 X 的结合序列，这被认为对肢体再生很重要。此外，ZRS突变体表现出严重的表型，其中它没有形成任何芽基，这表明它不仅对于确定前后轴而且对于肢体再生本身也很重要。由于ZRS的功能分析产生了超出我们最初预期的有趣结果，我们无法分析通过组学分析揭示的肢体再生中表达的分子的功能，但我们能够更接近两栖动物的再生机制我们能够获得重要的知识。我们还成功地确定了伊比利亚棕纹壁虎的安全港。利用我们实验室开发的 PITCh 敲入技术，我们尝试创建在该区域插入探针 (Mintbody) 序列的蝾螈，该序列可以分析组蛋白 H3 的乙酰化动态。转基因蝾螈在很长一段时间内（超过3个月）在全身稳定地表现出Mintbody特征的核特异性荧光，这为利用基因组编辑技术构建个体水平的基因功能分析系统提供了前景。未来，我们计划继续生产F1并确认向种系的传播。

项目成果

期刊论文数量（0）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

Cas9 ribonucleoprotein complex allows direct and rapid analysis of coding and noncoding regions of target genes in Pleurodeles waltl development and regeneration.

DOI：
10.1016/j.ydbio.2018.09.008
发表时间：
2018-11
期刊：
Developmental biology
影响因子：
2.7
作者：
Miyuki Suzuki;Toshinori Hayashi;Takeshi Inoue;K. Agata;M. Hirayama;Miyuzu Suzuki;S. Shigenobu;T. Takeuchi;Takashi Yamamoto;Ken-ichi T. Suzuki
通讯作者：
Miyuki Suzuki;Toshinori Hayashi;Takeshi Inoue;K. Agata;M. Hirayama;Miyuzu Suzuki;S. Shigenobu;T. Takeuchi;Takashi Yamamoto;Ken-ichi T. Suzuki

四肢再生芽の分子解剖と遺伝子機能解析

肢体胚基分子解剖及基因功能分析