Improvement of freezing tolerance of wheat by development of new strategy for transgene-free genome editing

通过开发非转基因基因组编辑新策略提高小麦的耐冻性

基本信息

批准号：
17F17747
负责人：
今井亮三
金额：
$ 1.41万
依托单位：
National Agriculture and Food Research Organization
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2017
资助国家：
日本
起止时间：
2017-11-10 至 2020-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-17F17747/
关键词：
低温馴化コムギ耐凍性越冬性フルクタンゲノム編集

项目摘要

フルクタン分解酵素遺伝子Wfh-sm3に対して切断を行うgRNAを5カ所（T1-T5）デザインした．このうち，T1については約2000個の茎頂を調整し，CRISPR/Cas9 RNPの撃ち込みを行った．第5葉CAPS解析の結果，7個体で変異と考えられる非切断バンドを検出した．T5では，600個の茎頂に対して撃ち込みを行い，5葉におけるCAPS解析の結果，2個体で変異が検出された．T2に対しては約3200個の茎頂を調整したが，変異が検出されず，T4も200処理個体中，変異検出は0個体であった，更に，in vitro Cas9切断活性を調べたところ２個体で変異が確定した．これらの非切断バンドを配列解析したところ，2塩基欠失と2塩基置換が検出された．FEH1に対して１カ所(T1)のgRNAをデザインした．フルクタン分解酵素遺伝子FEH1の変異体の作出については，600個体を処理し，このうち１個体で第５葉におけるCAPS解析でポジティブなシグナルを与えた．両遺伝子の合計で，冬コムギを用いて5000個以上の茎頂にボンバードメントを行った．春コムギに比べて茎頂組織が小さく取り扱いがしにくい上，種子のカビ汚染の問題があったため，全体的な変異体の獲得は低調だった． Whf-sm3については2個の変異系統，FEH1については1個体の候補系統が得られた点は評価できるが，それらの変異体がフルクタンの蓄積や耐凍性の向上をもたらすかについては，期限内に解析できなかった．

我们设计了 5 种切割果聚糖酶基因 Wfh-sm3 的 gRNA (T1-T5)。其中，T1 的约 2000 个茎尖经过调整并注射了 CRISPR/Cas9 RNP。第5叶CAPS分析的结果，在7个个体中检测到了被认为是突变的未切割条带。 T5时，射击600个茎尖，对5片叶子进行CAPS分析，结果在2个个体中检测到突变。 T2制备了大约3,200个芽尖，但没有检测到突变，而对于T4，在200个处理的植物中没有检测到突变。此外，在体外检查Cas9裂解活性，在个体中确认了突变。这些未切割条带的序列分析检测到两个碱基缺失和两个碱基取代。我们为 FEH1 设计了单个 (T1) gRNA。关于果聚糖酶基因FEH1突变体的创建，处理了600个个体，其中一个在第五片叶子的CAPS分析中给出了阳性信号。总共有超过 5000 个茎尖被使用冬小麦的两种基因轰击。芽尖组织比春小麦小，处理起来比较困难，而且种子存在霉菌污染的问题，所以突变体的整体获取速度缓慢。尽管我们已经获得了两个 whf-sm3 突变体系和一个 FEH1 候选系，但这些突变体是否会在期限内积累果聚糖并提高抗冻性仍有待观察。