多方向進化タンパク質群による硬組織形成システムの創出と理解

通过多向进化蛋白质创建和理解硬组织形成系统

基本信息

批准号：
21681026
负责人：
辻融
金额：
$ 13.4万
依托单位：
Keio University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (A)
财政年份：
2009
资助国家：
日本
起止时间：
2009 至 2011
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では、"Multi-Directed Protein Evolution(多方向タンパク質進化)"を提唱する。これはダイナミックなゲノム進化・再編を試験管内で模倣し、様々な機能性人工タンパク質を並行して創出する試みである。将来的には、得られるタンパク質同士が相互作用し、例えば硬組織形成のような一つのシステムが、自発的に創発するような反応場を設計したい。本研究では、概念実証例として、ハイドロキシアパタイト(HA)の結晶成長を制御するタンパク質群を創出する。これらを組み合わせて硬組織類似有機無機複合材料を構築し、医工学や再生医学分野に貢献する。具体的には、ゲノムのダイナミックな変化を、多数の構造および機能モチーフを組み合わせることで模倣する。そして、HAの結晶成長を制御するタンパク質群を、並行的に創出する。具体的には(1)HA核生成能をもつ、骨や歯で発現するhuman dentin matrix protein1の機能モチーフ2種類、(2)human bone sialoproteinとhuman osteopontin がもつ、2種類のコラーゲン結合モチーフ、(3)球状蛋白質の疎水性コアを形成する二次構造として、barnase由来の2種類の二次構造形成ペプチド、(4)進化分子工学的手法により取得されたチタン結合ペプチドである。計7種類のペプチドをRandom Multi-recombinant PCR法を用いてランダムにシャッフリングし、人工蛋白質のコンビナトリアル集団を構築した。得られた蛋白質を発現・精製し、それらのHA形成に及ぼす影響を調べた。HAの形成はpH変化を指標に調べた。その結果、集団の中からHA形成を促進する蛋白質と抑制する蛋白質のそれぞれを得ることが出来た。

在这项研究中，我们提出了“多向蛋白质进化”。这是在体外模拟动态基因组进化和重组并并行创建各种功能性人工蛋白质的尝试。未来，我想设计一个反应场，其中产生的蛋白质相互作用，并自发形成一个系统，例如硬组织形成。在本研究中，作为概念验证示例，我们将创建一组控制羟基磷灰石 (HA) 晶体生长的蛋白质。通过将这些材料组合起来，我们将构建一种类似硬组织的有机-无机复合材料，为医学工程和再生医学领域做出贡献。具体来说，它通过结合众多结构和功能基序来模拟基因组的动态变化。然后，一组控制透明质酸晶体生长的蛋白质将同时产生。具体而言，（1）具有透明质酸成核能力并在骨骼和牙齿中表达的人牙本质基质蛋白1的两种功能基序，（2）人骨唾液蛋白和人骨桥蛋白具有的两种胶原蛋白结合基序，（3 ）两种类型的源自芽孢杆菌RNA酶的二级结构形成肽被用作形成球状蛋白的疏水核心的二级结构，以及（4）通过进化分子工程技术获得的钛结合肽。使用随机多重重组PCR方法对总共七种类型的肽进行随机洗牌，以构建人工蛋白质的组合群。对获得的蛋白质进行表达和纯化，并研究它们对HA形成的影响。使用 pH 变化作为指标来研究 HA 的形成。结果，我们能够从群体中获得促进和抑制透明质酸形成的蛋白质。