無細胞タンパク質合成系を用いた新規HIV-1薬剤耐性検査法の基盤技術開発

利用无细胞蛋白质合成系统开发新型HIV-1耐药性检测方法的基础技术

基本信息

批准号：
21659116
负责人：
梁明秀
金额：
$ 1.09万
依托单位：
Yokohama City University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
财政年份：
2009
资助国家：
日本
起止时间：
2009 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-21659116/
关键词：
診断・治療エイズ HIV 薬剤耐性プロテアーゼ

项目摘要

無細胞タンパク質合成系を用いた新規HIV-1薬剤耐性表現系検査法の開発に成功した。酵素活性を指標とした薬剤耐性検査法の技術開発を目的として研究を行い、以下の結果を得た。i)無細胞合成法により生化学的アッセイに充分量の活性を保持したPRを合成することに成功した、ii) Gag内部切断配列p2-p7をデザインしたビオチン化人工基質の切断を、アタザナビル(ATV)、アンプレナビル(APV)、ダルナビル(DRV)、インディナビル(IDV)の4種のプロテアーゼ阻害剤(PI)存在下で定量的に検出することに成功した、iii)薬剤耐性変異G48S/I54V/V82F/L90Mを持つPRについて、4種のPIに対するIC50値を算出し、野生型PRと比較解析した結果、得られた耐性評価が従来法のウエスタンブロットによる解析結果や遺伝子検査法とよく一致することを確認したiv)患者血漿由来ウイルスRNAから、サブクローニングすることなく活性を保持したプロテアーゼを調製することに成功した。スタンフォード大学Robert Shafer博士より分与された詳細な感受性検査結果をもつHIV-1感染性分子クローン8種類について、上述の4種のPIに対する耐性検査を行い、遺伝子検査および感受性検査結果と比較することで、結果の妥当性を検証した。その結果、本手法と感受性検査を比較した場合に最もよく耐性評価が一致し(22/32検体)、続いて感受性検査と遺伝子検査(18/32検体)、本手法と遺伝子検査(16/32検体)であった。このことから本手法は、定量的にPRの薬剤耐性を評価できヽ得られた解析結果は感受性検査とよく一致することが示された。本研究成果については論文投稿準備中である。

我们利用无细胞蛋白质合成系统成功开发了一种新型HIV-1耐药表达系统测试方法。我们进行了研究，旨在开发一种以酶活性为指标的耐药性检测方法，并获得了以下结果。 i) 使用无细胞合成方法成功合成了具有足够活性用于生化测定的 PR，ii)使用 Gag 内部切割序列 p2-p7 设计的生物素化人工底物的切割使用四种蛋白酶抑制剂 (PI) 进行：阿扎那韦 (ATV)、安普那韦 (APV)、达芦那韦 (DRV) 和茚地那韦 (IDV)，成功检测到。 iii) 耐药突变 G48S/I54V/V82F/L90M 存在时定量。通过计算四种 PI 的 IC50 值并将其与野生型 PR 进行比较，我们确认获得的耐药性评估与传统的 Western blot 分析结果和基因检测方法非常一致 iv) 我们成功了。制备一种蛋白酶，该蛋白酶保留了患者血浆来源的病毒 RNA 的活性，无需亚克隆。上述四类PI的耐药性检测将针对八种HIV-1感染性分子克隆进行，并由斯坦福大学Robert Shafer博士提供详细的药敏试验结果，并与基因和药敏试验结果进行比较。验证了结果的有效性。结果，在比较该方法和药敏试验时，耐药性评估匹配最好（22/32样本），其次是药敏试验和基因检测（18/32样本），该方法和基因检测（16/32样本）样本）。这说明该方法可以定量评价PR中的耐药性，所得分析结果与药敏试验吻合较好。我们目前正在准备提交一篇有关这项研究结果的论文。