メダカトランスポゾンの線虫C.エレガンス研究への応用

青鳉转座子在秀丽隐杆线虫研究中的应用

基本信息

批准号：
21657057
负责人：
高木新
金额：
$ 2.05万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
财政年份：
2009
资助国家：
日本
起止时间：
2009 至 2011
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-21657057/
关键词：
トランスポゾン形質転換線虫ジーントラップ

项目摘要

本研究では最近開発された新規脊椎動物トランスポゾン実験系であるメダカTol1を線虫C.elegansに応用することを目指しており、当面の目標はTol1が挿入された線虫系統の作成である。今年度は、まず生殖系列細胞でのTol1トランスポゼース(TPase)高発現のために、pie-1プロモーターで駆動するTol1 TPaseを、蛍光蛋白質マーカーをもつTol1エレメントとともにcomplex array形成法によって遺伝子導入したが、挿入系統は作成できなかった。線虫では、マイクロインジェクションによって導入されたDNAはextrachromosomal array(EA)として染色体外で安定に維持される。ここまでの結果からTol1の生殖染色体への挿入頻度は当初の期待より低く、EA中のTol1エレメントの存在が染色体に挿入されたTol1検出の大きな障害となっていると考えられた。そこで、線虫生殖系列細胞でのMosIトランスポゾン置換反応用に開発されたMosSCI実験系を参考に、以下のTol1挿入系統の高感度検出系構築を試みた。ポジティブ選択マーカーとして野生型unc-119遺伝子断片をもつTol1エレメント、ネガティブ選択マーカーとしてrab-3::mCherry,myo-2::mCherry,myo-3::mCherryを用い、これらを生殖系列細胞で高い発現活性をもつglh-2遺伝子プロモーターによって駆動したTol1 TPaseとともにunc-119変異体の生殖巣にマイクロインジェクションした。F2世代以降でmCherry非発現かつunc-119変異運動異常救済を指標として挿入系統を検索したが、得られなかった。生殖細胞におけるTol1挿入頻度が現状では極めて低いと考えざるを得ず、本研究の成功には生殖系列細胞でのTol1転移率を飛躍的に高める方途を探る必要がある。

在本研究中，我们的目标是将最近开发的新型脊椎动物转座子实验系统青鳉 Tol1 应用于线虫秀丽隐杆线虫，我们的近期目标是创建插入 Tol1 的线虫菌株。今年，为了实现Tol1转座酶（TPase）在种系细胞中的高表达，我们使用复杂阵列形成方法引入了由pie-1启动子驱动的Tol1 TPase以及带有荧光蛋白标记的Tol1元件。被创建。在秀丽隐杆线虫中，通过显微注射引入的 DNA 作为染色体外阵列 (EA) 稳定地保持在染色体外。迄今为止的结果表明，Tol1插入生殖染色体的频率低于最初预期，EA中Tol1元件的存在被认为是检测Tol1插入染色体的主要障碍。因此，我们尝试使用为线虫种系细胞中MosI转座子取代反应开发的MosSCI实验系统构建以下Tol1插入系的高灵敏度检测系统。我们使用带有野生型 unc-119 基因片段的 Tol1 元件作为正选择标记，并使用 rab-3::mCherry、myo-2::mCherry、myo-3::mCherry 作为负选择标记，这些标记的选择性非常高。将由活性 glh-2 基因启动子驱动的 Tol1 TPase 显微注射到 unc-119 突变体的性腺中。我们在 F2 代后使用 mCherry 非表达和 unc-119 突变体运动异常的拯救作为指标来搜索插入系，但未能找到任何插入系。我们不禁想到，目前生殖细胞中Tol1插入的频率极低，为了这项研究的成功，有必要找到一种方法来大幅提高生殖细胞中Tol1的易位率。