in vitro肝組織再構築システムによる肝炎モデルの開発

利用体外肝组织重建系统建立肝炎模型

基本信息

批准号：
10J09464
负责人：
玉井美保
金额：
$ 0.9万
依托单位：
Tokyo Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2010
资助国家：
日本
起止时间：
2010 至 2011
项目状态：
已结题

项目摘要

肝組織の新たな細胞ソースとして増殖性を有する肝前駆細胞に着目した。本研究では実際に臨床応用を考えた際には行う事の出来ない化学薬品を用いた手法ではなく、ヒトへの応用が可能な門脈結紮により肝再生を誘発し肝臓内に肝前駆細胞増殖させ、コラゲナーゼ灌流法により単離し、限界希釈法で精製を行い肝前駆細胞の調製をおこなった。この肝前駆細胞を細胞ソースとし、閉鎖循環式バイオリアクターを用いて肝組織形成をおこなった。肝前駆細胞を用いることで初代培養肝細胞と比較して顕著な細胞生存の改善が見られた。遺伝子発現解析においても、肝前駆細胞は2次元単純培養では観られなかった成熟肝細胞のマーカーであるトリプトファン・ジオキシゲナーゼを、さらに胆管上皮細胞のマーカーであるサイトケラチン19も発現していた。組織学的な解析により、作製した肝組織は2核の肝細胞と胆管の形成が確認された。また、今回作製したin vitro肝組織の移植へ向けた検討をおこなった。移植した細胞挙動のより簡便な解析を可能とするため、赤色蛍光タンパク質発現マウスから胎仔繊維芽細胞を調製し、緑色蛍光タンパク質発現マウスより門脈結紮法により肝前駆細胞の調製をおこなった。この蛍光タンパク質発現細胞を各々用い作製した肝組織を、70%部分肝切除を行った野生型マウスの皮下と腸間膜上に移植した結果、マウス生体内で作製した肝組織が生着していることが確かめられ、肝組織内への血管侵入も観察された。比較実験としておこなったマトリゲル抱埋では、血管の新生が観られなかった。このことから、作製したコラーゲン細線維マトリックスはコラーゲン細線維に沿って血管の新生が誘導されやすいマトリックスであることが確認され、その移植へ向けた検討として前進したと考えられる。

我们专注于增殖性肝祖细胞作为肝组织的新细胞来源。在这项研究中，我们将通过可应用于人类的门静脉结扎来诱导肝脏再生，并在肝脏中增殖肝祖细胞，而不是使用在考虑实际临床应用时无法使用的化学物质的方法。使用胶原酶灌注法分离并使用有限稀释法纯化来制备。使用这些肝祖细胞作为细胞来源，使用闭路循环生物反应器进行肝组织形成。通过使用肝祖细胞，与原代培养的肝细胞相比，观察到细胞存活率显着提高。基因表达分析还表明，肝祖细胞表达色氨酸双加氧酶（成熟肝细胞的标记物），以及细胞角蛋白19（胆管上皮细胞的标记物），这在二维简单培养物中未观察到。组织学分析证实在制备的肝组织中形成双核肝细胞和胆管。我们还研究了移植我们创建的体外肝组织的可能性。为了更容易分析移植细胞的行为，从表达红色荧光蛋白的小鼠中制备胎儿成纤维细胞，并通过门静脉结扎从表达绿色荧光蛋白的小鼠中制备肝祖细胞。将使用这些表达荧光蛋白的细胞中的每一种制备的肝组织移植到进行了70%部分肝切除的野生型小鼠的皮下和肠系膜上，并且在小鼠体内制备的肝组织显示出移植。还观察到血管侵入肝组织。对比实验中Matrigel包埋未观察到新生血管。由此，确认了所制备的胶原原纤维基质是容易沿着胶原原纤维诱导新血管的基质，并且认为其移植研究已取得进展。