イソキノリンアルカロイド生合成系における転写因子ネットワークの解析

异喹啉生物碱生物合成系统转录因子网络分析

基本信息

批准号：
10J05542
负责人：
山田泰之
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2010
资助国家：
日本
起止时间：
2010 至 2012
项目状态：
已结题

项目摘要

1.ベルベリン生合成系の新規遺伝子発現調節因子、新規転写因子の探索のために、GFP抗体を用いた共免疫沈降(Co-IP)、ならびにLC-MS/MS解析により転写因子の相互作用因子の同定を試みた。その結果、調節因子や転写因子のようなタンパク質は同定されなかったが、CjbHLH1,CjWRKY1ともに翻訳後修飾による制御を受けている可能性が示唆された。一方、ESTの再アノテーションとce11 1ine間での発現比較、さらに二本鎖RNAを用いた一過的RNAiスクリーニングを行ったが、新たな転写因子を得るにはいたらなかった。2.sGFP-CjbHLH1を導入したハナビシソウ培養細胞株を複数ライン確立し、ゲノムPCRやqRT-PCR解析、および抗CjbHLH1抗体を用いたウェスタン解析を行い、形質転換体におけるsGFP-CjbHLH1の発現を確認した。一方、サンギナリン生合成に関わる酵素遺伝子の発現量は、コントロールとの間に差は見られず、単独での過剰発現ではほとんど生合成系に影響が見られない可能性が示唆された。また、ハナビシソウCjbHLH1ホモログ、EcbHLH1の37bpRNAi発現抑制株も複数ライン確立し、抑制の強い株の選抜を進めている。3.ジャスモン酸シグナル伝達系に関わるMYC2ホモログやJAZがベルベリン生合成系の制御に関わるかどうかを調べるために、オウレン、ハナビシソウからそれぞれMYC2遺伝子を、さらにオウレンから2つのJAZ遺伝子を単離し、これらの遺伝子の発現がMeJAに対して応答することを確認した。また、ce11 1ine間でのCjMYC2遺伝子の発現比較やハナビシソウ植物体におけるEcMYC2の組織別発現解析を行ったが、生合成酵素遺伝子の発現との相関は見られなかった。さらに、一過的RNAiによるCjMYC2の発現抑制の影響は一部の生合成酵素遺伝子に限定されており、その抑制効果もCjbHLH1に比べると低かった。また、CjbHLH1やCjwRKY1の発現量には全く影響が見られず、これらの因子は独立に制御を受けている可能性が示唆された。一方、CjJAZについては一過的過剰発現により生合成酵素遺伝子の発現量が減少していたことから、リプレッサーとして機能していることが示唆された。

1.为了寻找小檗碱生物合成系统中的新型基因表达调节因子和新型转录因子，进行了使用GFP抗体的免疫共沉淀(Co-IP)和LC-MS/MS分析来鉴定转录因子的相互作用因子的尝试。是为了识别结果，虽然没有鉴定出调节因子或转录因子等蛋白质，但表明CjbHLH1和CjWRKY1可能都受到翻译后修饰的调节。另一方面，我们进行了EST重新注释、ce11 1ine之间的表达比较以及使用双链RNA的瞬时RNAi筛选，但我们无法获得新的转录因子。 2.我们建立了多个sGFP-CjbHLH1培养细胞系，并通过基因组PCR、qRT-PCR分析和使用抗CjbHLH1抗体的Western分析证实了sGFP-CjbHLH1在转化子中的表达。另一方面，与对照相比，参与血根碱生物合成的酶基因的表达水平没有观察到差异，这表明单独的过表达可能对生物合成系统几乎没有影响。此外，我们还针对EcbHLH1同源物EcbHLH1建立了多株37bp RNAi表达抑制株系，目前正在筛选具有强抑制作用的菌株。 3.为了研究茉莉酸信号转导系统中涉及的MYC2同源物和JAZ是否参与小檗碱生物合成系统的调控，我们分别分离了东方花草中的MYC2基因和东方花草中的两个JAZ基因。我们证实这些基因的表达对 MeJA 有反应。此外，我们比较了CjMYC2基因在ce11 1ine中的表达量，并分析了EcMYC2在紫苏植株不同组织中的表达量，但未发现与生物合成酶基因表达量的相关性。此外，瞬时RNAi抑制CjMYC2表达的效果仅限于部分生物合成酶基因，其抑制效果也低于CjbHLH1。此外，未观察到对 CjbHLH1 和 CjwRKY1 表达水平的影响，表明这些因素可能是独立调节的。另一方面，对于CjJAZ来说，生物合成酶基因的表达水平由于短暂的过度表达而降低，这表明它具有阻遏物的功能。