電位センサータンパク質の作用機序に対する物理化学的手法を用いた解析

用物理化学方法分析电压传感器蛋白的作用机制

基本信息

批准号：
10J01585
负责人：
川鍋陽
金额：
$ 1.79万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2010
资助国家：
日本
起止时间：
2010 至 2012
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では、電位センサータンパク質であるVSOP(電位依存性プロトンチャネル)の電位感知メカニズムをはじめとする基本的な性質を、電気生理学的な手法(主にパッチクランプ法)と物理化学的手法(主に赤外分光法)を組み合わせて明らかにすることが目標である。本年度の研究成果の概要を以下に記述する。前年度までに活性のあるマウス由来VSOPを発現する系を確立した。本年度は計測のさらなる改善と薬理効果を検討するための培養細胞系を用いた評価を行っている。1.全反射赤外分光法にて基質結合やpH変化に伴う構造変化の解析を行ったが、精度のよいスペクトルを得ることができなかった。前年度に引き続き、タンパク質と脂質の比率を見直すなど条件検討をし直している。2.プロテオリポソームに対してパッチクランプ法を適用する電気生理学的な解析を前年度に引き続き試みている。VSOPはそのコンダクタンスが数百fS程度と極めて小さいと示唆されており、これは、一般的なK^+,Na^+などを通すイオンチャネルの1/1000のレベルである。そこで、可能な限りノイズが入らない環境で新たに測定装置を組み上げ、現在予備実験の段階であるが、VSOP由来とみられる電流を計測することに成功した。今後さらに解析していくために、亜鉛イオンや下記の不飽和脂肪酸への応答性などの薬理効果を見ていく予定である。3.電位依存性プロトンチャネルはその分子実体が判明する前から不飽和脂肪酸(主にアラキドン酸)により電流が増大することが知られていた。しかし、それらはネイティブの細胞の結果であり、メカニズムの詳細などに迫る強制発現系での実験はこれまでになかった。培養細胞を用いたインサイドアウトパッチクランプ法で測定したところ、不飽和脂肪酸の効果で電流が増大することがわかった。これは不飽和脂肪酸が直接作用することを示唆しており今後、部位の特定やメカニズムに迫っていきたい。

在本研究中，我们利用电生理学方法（主要是膜片钳法）和物理化学方法（主要是膜片钳法）和物理化学方法（主要是膜片钳法）研究了电压传感蛋白VSOP（电压依赖性质子通道）的基本性质，包括其电压传感机制。红外光谱（红外光谱）。现将今年的研究成果总结如下。到去年，我们已经建立了一个表达活性小鼠 VSOP 的系统。今年，我们正在使用培养细胞系统进行评估，以进一步改进测量和检查药理作用。 1.我们使用全内反射红外光谱分析了与底物结合和pH变化相关的结构变化，但无法获得准确的光谱。延续去年，我们正在重新考虑条件，包括审查蛋白质和脂肪的比例。 2.继去年之后，我们正在尝试使用膜片钳法对蛋白脂质体进行电生理分析。有人认为VSOP的电导极小，约为数百fS，是通过K^+、Na^+等的一般离子通道水平的1/1000。因此，我们在噪音尽可能小的环境中组装了新的测量装置，虽然目前还处于初步实验阶段，但我们成功地测量了似乎源自VSOP的电流。为了进一步分析，我们计划研究药理作用，例如对锌离子和下面列出的不饱和脂肪酸的反应性。 3.人们知道，甚至在分子实体未知之前，不饱和脂肪酸（主要是花生四烯酸）就会增加电压门控质子通道的电流。然而，这些结果来自天然细胞，迄今为止还没有使用强制表达系统的实验来探索该机制的细节。当使用培养细胞使用内向外膜片钳法进行测量时，发现由于不饱和脂肪酸的作用，电流增加。这表明不饱和脂肪酸直接起作用，将来我们希望确定该位点并研究其机制。