Structural and functional analysis of bacterial type IV secretion system

IV型细菌分泌系统的结构和功能分析

基本信息

批准号：
17J40044
负责人：
安藤(北尾) 公英
金额：
$ 2.83万
依托单位：
Gifu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2017
资助国家：
日本
起止时间：
2017-04-26 至 2020-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究ではレジオネラの感染に必須のDot/Icm IV型分泌装置の3つのATPaseの役割に着目し研究を実施した。これまでに、内膜に局在するDot/Icmタンパク質DotIとDotJが安定なヘテロ内膜複合体を形成すること、また、このヘテロ内膜複合体と3つのATPaseのうちの1つとの間に遺伝学的相互作用が見られることがわかっている。そこで、本研究ではこのヘテロ内膜複合体とATPaseの構造解析に向けて、これらの生化学的な相互作用について解析した。具体的には、StrepタグとFLAGタグを用いてヘテロ内膜複合体とATPaseの3者を同時発現可能な系を構築し、大腸菌内で発現誘導後に、3者複合体が内膜で形成されるかどうかを調べた。まず、発現誘導後に菌を破壊し、界面活性剤を用いて膜画分を抽出、そして、ゲル濾過カラムを用いて3者複合体を含む可能性のある画分を得た。続いて、この画分をブルーネイティブPAGEと抗ATPase抗体を用いたウェスタンブロットにより解析した結果、3者複合体は、約700kDaの複合体の画分に含まれていることが明らかになり、ヘテロ内膜複合体とATPaseが直接的に相互作用している可能性を示唆していた。同時に、同様の系で精製したヘテロ内膜複合体のみを用いて、電子顕微鏡下で構造を観察した。しかし、タンパク質複合体を確認できたものの、複合体濃度の調整と、支持膜の条件検討が必要であることがわかった。今後は、ヘテロ内膜複合体とATPaseの3者複合体の構造解析を引き続き進めていく予定である。

这项研究的重点是三个ATPases在DOT/ICM IV型分泌装置中的作用，这对于军团菌感染至关重要。迄今为止，已经发现DOT/ICM蛋白DOTI和DOTJ位于内膜，形成稳定的杂膜复合物，并且在该杂膜复合物与三个ATPases之一之间观察到了遗传相互作用。因此，在这项研究中，我们分析了这种异源复合物和ATPase的生化相互作用。具体而言，一个能够使用链球菌标签和标志标签共同表达异质症状复合物和ATPase的系统用于构建能够共表达异触发复合物和ATPase的系统，并确定在E. coli中表达诱导后在内膜中形成的三翼矿是否形成。首先，在表达诱导后破坏细菌，使用表面活性剂提取膜级分，并使用凝胶过滤柱获取可能包含三部分复合物的馏分。随后，通过使用蓝色天然页面和抗ATPase抗体进行蛋白质印迹分析了这一部分，并揭示了三方复合物包含在大约700 kDa的络合物的比例中，这表明杂膜复合物和ATPase直接相互作用。同时，仅使用在同一系统中纯化的杂体复合物在电子显微镜下观察结构。然而，尽管确认了蛋白质复合物，但发现需要调整复杂浓度和支撑膜条件。将来，我们计划继续对杂点复合物和ATPase的三部分复合物进行结构分析。