新規癌ワクチン製剤としての利用を目的とした機能性癌細胞由来エキソソームの開発

开发功能性癌细胞衍生的外泌体，用作新的癌症疫苗制剂

基本信息

批准号：
16J11152
负责人：
森下将輝
金额：
$ 0.83万
依托单位：
Kyoto Pharmaceutical University (2017)Kyoto University (2016)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2016
资助国家：
日本
起止时间：
2016-04-22 至 2018-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

近年、細胞分泌性の膜小胞であるエキソソームを利用した疾患の新規診断法や治療法を開発する試みが盛んに行われている。中でも、癌細胞由来エキソソームは癌抗原を内包しており、抗腫瘍免疫反応を誘導可能であることから、癌抗原の同定を必要としない新規癌ワクチン製剤としての利用が期待されている。しかしながらその実現には、抗原提示細胞である樹状細胞(DC)への指向性、DCの活性化、DC上の抗原提示分子への癌抗原の送達等の条件を満たす癌細胞由来エキソソームの開発が必要である。特に癌抗原の提示に関して、Exoを取り込んだ樹状細胞（DC）の細胞質への抗原送達による、癌抗原のMHCクラスI分子による提示が望ましい。しかし、DCに取り込まれたExoは主にエンドソームに輸送される。そこで本検討では、DCに取り込まれたExoの細胞質への効率的な輸送を試みた。癌細胞としてマウスメラノーマ細胞株B16BL6を、エンドソーム脱出能を有する機能分子としてGALAペプチドを選択し、アビジン－ビオチン結合を利用してGALA修飾Exo（GALA-Exo）を調製した。カルセイン封入リポソームを利用した膜傷害性を評価したところ、酸性条件下においてGALA-Exo添加後のカルセイン漏出が確認されたことから、GALA-Exoの膜傷害性が示された。続いて、GALA-Exoの内包物を蛍光標識し、マウス樹状細胞株DC2.4へ添加した。その結果、細胞質全体へのExo内包物の分布が観察された。さらに、GALA-Exoの処理によりDC2.4とMHCクラスIに提示されたメラノーマ抗原に反応性を有するT細胞株BUSA14の共培養時に産生されるIL-2が有意に増大した。以上の結果より、GALA修飾を施すことでExo内包物の細胞質への輸送を促進し、細胞内動態の制御に基づく癌抗原のMHCクラスI提示能の増強に成功した。

近年来，人们进行了许多尝试，利用外泌体（细胞分泌的膜囊泡）开发新的疾病诊断和治疗方法。其中，癌细胞来源的外泌体含有癌抗原，能够诱导抗肿瘤免疫反应，因此有望用作不需要识别癌抗原的新型癌症疫苗制剂。然而，为了实现这一目标，有必要开发源自癌细胞的外泌体，以满足诸如对抗原呈递细胞树突状细胞（DC）的趋向性、DC的激活以及将癌抗原递送至抗原呈递分子等条件在 DC 上是必要的。特别是关于癌抗原的呈递，通过将抗原递送至负载外源的树突状细胞(DC)的细胞质中而由MHC I类分子呈递癌抗原是理想的。然而，DC 摄取的 Exo 主要转运至内体。因此，在本研究中，我们试图将 DC 摄取的 Exo 有效转运到细胞质中。选择小鼠黑色素瘤细胞系B16BL6作为癌细胞，选择GALA肽作为能够逃逸内体的功能分子，并利用抗生物素蛋白-生物素结合制备GALA修饰的Exo（GALA-Exo）。当使用钙黄绿素封装的脂质体评估膜毒性时，在酸性条件下添加GALA-Exo后证实了钙黄绿素渗漏，表明GALA-Exo的膜毒性。随后，GALA-Exo 内含物被荧光标记并添加到小鼠树突状细胞系 DC2.4 中。结果，观察到 Exo 内含物分布在整个细胞质中。此外，GALA-Exo 处理显着增加了 DC2.4 和 BUSA14（一种对 MHC I 类呈递的黑色素瘤抗原有反应的 T 细胞系）共培养期间产生的 IL-2。基于上述结果，我们通过应用GALA修饰，成功地在控制细胞内动力学的基础上，促进Exo包涵体转运至细胞质，并增强癌抗原的MHC I类呈递能力。