分子鋳型法を用いた光アンテナ形成に基づく１細菌検出

1.基于分子模板法光学天线形成的细菌检测

基本信息

批准号：
16J07230
负责人：
木下隆将
金额：
$ 0.83万
依托单位：
Osaka Prefecture University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2016
资助国家：
日本
起止时间：
2016-04-22 至 2018-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-16J07230/
关键词：
金属ナノ粒子細菌分析分子鋳型細菌検出散乱光

项目摘要

本研究では，金属ナノ粒子の光散乱特性と分子鋳型ポリマの特異結合能の利用により，特定の細菌表面に光アンテナを形成することで，高選択的かつ高感度な検出を目指した。第1年目は，多数の金ナノ粒子を内包したポリマナノ粒子（ナノコンポジット）にO157抗原に相補的な分子鋳型を形成することにより，大腸菌O157への特異的な光アンテナ形成に成功した。本年度は，ナノコンポジット使用条件の最適化および温度サイクルに対する耐久性試験を行った。得られた知見に基づき，実分析への応用について検討した。ナノコンポジットのマトリクスポリマは32℃以下において親水性を示し，それ以上の温度では疎水化する。25℃の水溶液中において，ナノコンポジットは大腸菌O157に結合し，菌体は暗視野化において強い白色散乱光として観察された。一方で，40℃においてナノコンポジットと菌体の結合は確認されなかった。水溶液を25℃に再冷却したところ，再びナノコンポジットは菌体へ結合したことから，最適使用温度を25℃と決定した。また，この温度サイクルを10回行ったところ，各温度における単一菌体の散乱強度は可逆的に変化した。このことから，ナノコンポジットの結合性および光学特性は温度サイクルに対して優れた耐久性を有することが分かった。腐らせた牛肉から得られた細菌を水溶液中に抽出し，遠心分離により不純物を除去した。この水溶液に大腸菌O157を所定量ずつ加え，続いてナノコンポジットを添加した。暗視野化において，一部の菌体から強い白色散乱光が観察された。さらに，視野全体の散乱強度は大腸菌O157の含有率が高くなるにしたがい単調に増大した。これはナノコンポジットが大腸菌O157にのみ特異結合したことを意味している。これらのことから，暗視野顕微鏡を用いた実試料中の特定菌種の識別，および視野全体の散乱強度に基づく定量的検出を達成した。

在本研究中，我们的目标是利用金属纳米颗粒的光散射特性和分子模板聚合物的特异性结合能力，在特定细菌的表面形成光学天线，从而实现高选择性和灵敏的检测。第一年，我们通过在含有许多金纳米颗粒的聚合物纳米颗粒（纳米复合材料）中形成与O157抗原互补的分子模板，成功地形成了大肠杆菌O157的特异性光学天线。今年，我们优化了纳米复合材料的使用条件，并进行了针对温度循环的耐久性测试。根据所获得的知识，我们考虑将其应用于实际分析。纳米复合材料的基质聚合物在低于32℃的温度下表现出亲水性，并在高于该温度的温度下变得疏水性。在25℃的水溶液中，纳米复合材料与大肠杆菌O157结合，在暗视野中观察到细菌细胞呈强白色散射光。另一方面，在 40°C 下，纳米复合材料与细菌细胞之间没有结合。当水溶液重新冷却至25℃时，纳米复合材料再次与细菌细胞结合，因此确定最佳使用温度为25℃。此外，当这个温度循环重复10次时，单个细菌细胞在每个温度下的散射强度都会发生可逆的变化。这表明纳米复合材料的粘合和光学性能具有优异的温度循环耐久性。将从变质牛肉中获得的细菌提取到水溶液中，并通过离心去除杂质。将预定量的大肠杆菌O157添加到该水溶液中，然后添加纳米复合材料。在暗场成像中，从一些细菌细胞中观察到强烈的白色散射光。此外，随着大肠杆菌 O157 含量的增加，整个视场的散射强度单调增加。这意味着纳米复合材料仅与大肠杆菌 O157 特异性结合。基于这些发现，我们成功地使用暗视野显微镜识别了真实样品中的特定细菌种类，并根据整个视场的散射强度对其进行定量检测。