エゾサンショウウオにおける温度依存的な性決定・性分化機構の解析

虾夷蝾螈温度依赖性性别决定和性别分化机制分析

基本信息

批准号：
09J01941
负责人：
宇野好宣
金额：
$ 0.9万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2009
资助国家：
日本
起止时间：
2009 至 2010
项目状态：
已结题

项目摘要

性転換個体の遺伝的な性を判別するためのW染色体特異的分子マーカーを作製するため、雌雄個体から抽出したゲノムDNAを20数種類の制限酵素で消化し、電気泳動で検出された雌特異的な反復配列のクローニングを行った。しかし、W染色体特異的分子マーカーを作製することができなかった。そこで、雌雄のゲノムDNAをテンプレートとして使用しランダムプライマーを用いてPCRを行うRAPD解析を行い、アクリルアミドゲルを用いた電気泳動により、メス特異的に検出されたDNAバンドからW特異的なフラグメントのクローニングを試みた。300通りのプライマーの組み合わせを行ったが、この実験でもメス特異的なバンドを検出することができなかった。次に、本研究での発現解析のためにクローニングした、性分化関連遺伝子のサンショウウオホモログの染色体マッピングを行うことで、エゾサンショウウオの性染色体連鎖遺伝子を同定し、その遺伝子のZ染色体連鎖ホモログとW染色体連鎖ホモログの塩基配列を詳細に解析することで、新たな性判別マーカーを作製することができるのではないかと考えた。しかしながら、単離されたすべての性分化関連遺伝子はエゾサンショウウオでは常染色体にマップし、性染色体連鎖遺伝子を同定することができなかった。今後はまだ単離していない性分化関連遺伝子などの機能遺伝子のサンショウウオホモログのクローニング・染色体マッピングを行い、新たな性連鎖遺伝子を同定することで、性判別マーカーの作製を試みている。しかしながら、サンショウウオの染色体標本は非常に難しく、現在の方法では良好な染色体標本を数多く得ることが困難である。したがって、今後は染色体標本作製における細胞培養方法を新たに確立する必要がある。

为了创建W染色体特异性分子标记来确定变性个体的遗传性别，从男性和女性个体中提取的基因组DNA用20多种限制性内切酶消化，并通过电泳检测女性特异性分子标记制备了重复序列。然而，不可能创建 W 染色体特异性分子标记。因此，我们进行了RAPD分析，其中以两性的基因组DNA为模板，使用随机引物进行PCR，并通过使用丙烯酰胺凝胶的电泳，从我在女性中特异检测到的DNA条带中克隆了W特异性片段。。尽管使用了300个引物组合，但在该实验中没有检测到女性特异性条带。接下来，通过对本研究中克隆用于表达分析的性别分化相关基因的蝾螈同源物进行染色体作图，我们鉴定了虾夷蝾螈的性染色体连锁基因，并鉴定了该基因的Z染色体连锁同源物和W We认为通过详细分析染色体连锁同源物的核苷酸序列，可能可以创建新的性别歧视标记。然而，所有分离的性别分化相关基因都映射到虾夷蝾螈的常染色体上，并且无法鉴定出与性染色体相关的基因。未来，我们将尝试通过对尚未分离的性别分化相关基因等功能基因的蝾螈同源物进行克隆和染色体定位，并通过鉴定新的性别相关基因来创建性别歧视标记。然而，蝾螈染色体标本的获取极其困难，利用现有的方法很难获得大量良好的染色体标本。因此，未来有必要建立一种新的细胞培养方法来制备染色体标本。