殺虫タンパク質の昆虫特異的な毒性を決定する受容体の解明とタンパク質工学への応用

确定杀虫蛋白昆虫特异性毒性的受体的阐明及其在蛋白质工程中的应用

基本信息

批准号：
15J08610
负责人：
遠藤悠
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Tokyo University of Agriculture and Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2015
资助国家：
日本
起止时间：
2015-04-24 至 2017-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15J08610/
关键词：
殺虫性タンパク質 Bacillus thuringiensis Cry toxin ABCトランスポーター

项目摘要

本年度はまず，「受容体に対する結合親和性を高めるとCry毒素の毒性も高まるはずである」という作業仮説を検証した．カイコガABCC3およびコクヌストモドキABCC4Aに対してCry毒素は非常に高い結合親和性を示し，「結合親和性の高低」と「受容体発現培養細胞の細胞傷害の高低」は概ね相関した．Cry毒素はABCトランスポーター以外にも複数の受容体分子が報告されているが，結合親和性の高低と受容体機能の高低に相関が認められるCry毒素受容体は，ABCトランスポーターが初めてである。すなわち，このことはABCトランスポーターがCry毒素改良のためのタンパク質工学の標的分子としてふさわしいことを示唆した．さらに，ABCトランスポーターのCry毒素に対する特異性は，細胞外ループのアミノ酸残基によって決定されることを明らかにした．つまり，Cry毒素の結合性を高めるにはこの細胞外ループ領域を標的とすればよいことが示唆された．次に，「ABCトランスポーターに対して結合親和性の高まったCry毒素変異体の選抜」を試みようとしたが，難溶性の膜タンパク質であることもあり，ABCC2の大量調製のための条件検討に時間を要した。したがって，これを用いたタンパク質工学の実施には至らなかった．しかしながら，本研究の最終目的である「人為的な改変による有効なCry毒素の創出」は，結合解析によって理論的基盤が得られたこと，および受容体タンパク質の大量調製が可能になり実験系がほぼ構築されつつあることによって，当初よりもかなり現実味を帯びたものとなった．

今年，我们首先测试了“增加受体的结合亲和力应该会增加 Cry 毒素的毒性”的工作假设。 Cry毒素对家蚕ABCC3和家蚕ABCC4A表现出非常高的结合亲和力，并且“高/低结合亲和力”通常与“表达受体的培养细胞的高/低细胞毒性”相关。尽管除 ABC 转运蛋白外还报道了多种 Cry 毒素受体分子，但 ABC 转运蛋白是第一个观察到结合亲和力水平与受体功能水平之间相关性的 Cry 毒素受体。这表明ABC转运蛋白适合作为蛋白质工程的靶分子来改善Cry毒素。此外，我们还发现 ABC 转运蛋白对 Cry 毒素的特异性是由细胞外环中的氨基酸残基决定的。这表明可以靶向该细胞外环区域来增加 Cry 毒素的结合。接下来，我们试图“选择对ABC转运蛋白具有更高的结合亲和力的Cry毒素突变体”，但由于它是一种难溶性膜蛋白，我们需要时间来研究大规模制备ABCC2的条件。因此，我们还无法利用它来实现蛋白质工程。然而，这项研究的最终目标“通过人工修饰创造出有效的Cry毒素”之所以得以实现，是因为通过结合分析获得了理论基础，并且实验系统通过使得可以制备大量的Cry毒素成为可能。由于它即将被构建，它已经变得比原来更加现实。