マイクロ流体技術を用いた新規なタンパク質結晶構造解析ツールの開発

利用微流控技术开发新型蛋白质晶体结构分析工具

• 批准号: 15J04557
• 负责人: 真栄城 正寿
• 金额: $ 1万
• 依托单位: Hokkaido University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2015
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2015-04-24 至 2016-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15J04557/
• 关键词: マイクロデバイス; タンパク質; 結晶化; X線回折

今年度は、マイクロ流体技術を用いた結晶化制御方法の確立に取り組んだ。タンパク質結晶化は、これまでは熟練者の勘や経験に大きく依存していた。結晶化制御は経験則に基づくことが多く、系内で複数の単結晶が合体や密集すると構造解析が困難になる。そこで、マイクロ流体制御技術と種結晶法を組み合わせたタンパク質結晶化制御方法の確立を試みた。まず、共同研究者から提供を受けた南極産好冷細菌由来のグルコキナーゼ（PsGK）の結晶化制御を行った。PsGKは、従来の結晶化方法（ハンギングドロップ蒸気拡散法）では、結晶同士が集積して良質な単結晶を作製することが困難であった。しかしながら、結晶化空間を精密に制御したマイクロ流体デバイスを用いることで、結晶化の制御が可能であった。また、結晶化空間のサイズ（深さ）によって、結晶化挙動が大きく変化することが明らかになった。具体的には、深さが50μmの結晶化空間ではロッド状の結晶が析出したが、深さが10μmの結晶化空間ではプレート状の結晶が析出した。この現象の普遍性を確認するために、リゾチーム、およびNADPH-シトクロムP450還元酵素-ヘムオキシゲナーゼ（CPR-HO）複合体の結晶化挙動の解析と制御に取り組んだ。CPR-HO複合体の結晶も従来の結晶化方法（ハンギングドロップ蒸気拡散法）では、結晶同士の集積が確認された。一方で、マイクロ流体デバイスでは、1個の単結晶のみを析出させることができた。

今年，我们致力于建立一种利用微流控技术的结晶控制方法。到目前为止，蛋白质结晶在很大程度上依赖于专家的直觉和经验。结晶控制通常基于经验规则，当多个单晶在系统中合并或聚集在一起时，结构分析变得困难。因此，我们尝试建立一种将微流控技术与晶种法相结合的蛋白质结晶控制方法。首先，他们控制了来自南极嗜冷细菌的葡萄糖激酶（PsGK）的结晶，这是由合作者提供的。当使用传统的PsGK结晶方法（悬滴气相扩散法）时，由于晶体的堆积，很难生产出高质量的单晶。然而，可以通过使用精确控制结晶空间的微流体装置来控制结晶。还表明，结晶行为根据结晶空间的大小（深度）而发生很大变化。具体而言，在深度为50μm的结晶空间中析出棒状晶体，在深度为10μm的结晶空间中析出板状晶体。为了证实这种现象的普遍性，我们分析和控制了溶菌酶和 NADPH-细胞色素 P450 还原酶-血红素加氧酶 (CPR-HO) 复合物的结晶行为。当使用常规结晶方法（悬滴蒸气扩散法）时，证实CPR-HO复合物的晶体彼此聚集。另一方面，使用微流体装置只能沉积一个单晶。

项目成果

マイクロ化学チップの最新動向：紙チップとタンパク質結晶構造解析チップ

微化学芯片最新趋势：纸芯片和蛋白质晶体结构分析芯片

• 发表时间: 2015
• 期刊: グリーンテクノロジー
• 作者: 真栄城正寿;渡慶次学
• 通讯作者: 渡慶次学

University of Illinois(米国)

伊利诺伊大学（美国）

An Approach for Controlling Epitaxial Growth of Protein Crystal by Using Microfluidic Device

利用微流控装置控制蛋白质晶体外延生长的方法

• 发表时间: 2015
• 作者: Maeki M;Pawate A S;Sugishima M;Watanabe K;Tokeshi M;Kenis P J A;Miyazaki M
• 通讯作者: Miyazaki M

Development of Microfluidic Device for Protein Crystallization and Its Application for X-ray Analysis

蛋白质结晶微流控装置的研制及其在X射线分析中的应用

• 发表时间: 2015
• 作者: Maeki M;Pawate A S;Sugishima M;Watanabe K;Tokeshi M;Kenis P J A;Miyazaki M
• 通讯作者: Miyazaki M

Protein Crystal Growth in Confined Space of Microfluidic Device

微流控装置密闭空间中蛋白质晶体的生长

• 发表时间: 2015
• 作者: Maeki M;Pawate A S;Sugishima M;Watanabe K;Tokeshi M;Kenis P J A;Miyazaki M
• 通讯作者: Miyazaki M