マイクロ流体技術を用いた新規なタンパク質結晶構造解析ツールの開発

利用微流控技术开发新型蛋白质晶体结构分析工具

• 批准号: 15J04557
• 负责人: 真栄城 正寿
• 金额: $ 1万
• 依托单位: Hokkaido University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2015
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2015-04-24 至 2016-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15J04557/
• 关键词: マイクロデバイス; タンパク質; 結晶化; X線回折; マイクロデバイス; タンパク質; 結晶化; X線回折

今年度は、マイクロ流体技術を用いた結晶化制御方法の確立に取り組んだ。タンパク質結晶化は、これまでは熟練者の勘や経験に大きく依存していた。結晶化制御は経験則に基づくことが多く、系内で複数の単結晶が合体や密集すると構造解析が困難になる。そこで、マイクロ流体制御技術と種結晶法を組み合わせたタンパク質結晶化制御方法の確立を試みた。まず、共同研究者から提供を受けた南極産好冷細菌由来のグルコキナーゼ（PsGK）の結晶化制御を行った。PsGKは、従来の結晶化方法（ハンギングドロップ蒸気拡散法）では、結晶同士が集積して良質な単結晶を作製することが困難であった。しかしながら、結晶化空間を精密に制御したマイクロ流体デバイスを用いることで、結晶化の制御が可能であった。また、結晶化空間のサイズ（深さ）によって、結晶化挙動が大きく変化することが明らかになった。具体的には、深さが50μmの結晶化空間ではロッド状の結晶が析出したが、深さが10μmの結晶化空間ではプレート状の結晶が析出した。この現象の普遍性を確認するために、リゾチーム、およびNADPH-シトクロムP450還元酵素-ヘムオキシゲナーゼ（CPR-HO）複合体の結晶化挙動の解析と制御に取り組んだ。CPR-HO複合体の結晶も従来の結晶化方法（ハンギングドロップ蒸気拡散法）では、結晶同士の集積が確認された。一方で、マイクロ流体デバイスでは、1個の単結晶のみを析出させることができた。

今年，我们致力于建立一种使用微流体技术控制结晶的方法。蛋白质结晶以前已经严重取决于熟练人士的直觉和经验。结晶控制通常基于经验规则，当多个单晶体组合或聚集在系统中时，结构分析变得困难。因此，我们试图建立一种蛋白质结晶控制方法，该方法将微流体控制技术与种子结晶相结合。首先，我们控制了葡萄糖激酶（PSGK）的结晶，该结晶源自协作研究人员提供的南极脊椎细菌。在PSGK中，常规的结晶方法（悬挂液蒸气扩散法）使得很难将晶体聚集在一起产生高质量的单晶。但是，通过使用精确控制结晶空间的微流体设备，可以控制结晶。还揭示了结晶行为根据结晶空间的大小（深度）而发生巨大变化。具体而言，在50μm深度的结晶空间中沉淀出棒状晶体，但板状晶体在10μm深度的结晶空间中沉淀。为了确认这种现象的普遍性，我们致力于分析和控制溶菌酶和NADPH-CYTOCHROME P450还原酶 - 血红素 - 氧合酶（CPR-HO）复合物的结晶行为。通过常规结晶（悬挂液蒸气扩散法）证实了CPR-HO复合物晶体的积累。另一方面，只能将一个单晶沉积在微流体装置中。