未知補因子が関与するＲＮＡ硫黄転移機構の構造基盤

涉及未知辅因子的RNA硫转移机制的结构基础

基本信息

批准号：
15J01961
负责人：
陳明皓
金额：
$ 1.6万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2015
资助国家：
日本
起止时间：
2015-04-24 至 2018-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本年度はTtuAの活性部位周辺の残基に網羅的にアラニン変異を導入したのち、HPLCを用いてTtuAの酵素活性実験、また水銀ゲルを用いてTtuBの脱硫実験を行った。その結果、残基Ser55、Asp59、Asp161およびLys137にアラニン変異を導入すると酵素活性がほぼまたは完全に阻害されることを見出した。構造情報から、前者の3残基は基質塩基のアデニル化、後者の１残基はTtuBの脱硫反応に関与する仮説を立てた。TtuAに含まれている[4Fe4S]型鉄硫黄クラスターは、活性部位に進入するTtuBまたは硫黄イオンと配位できるとX線結晶構造より観測されている。しかし、この推定された鉄硫黄クラスターの機能は結晶中だけでなく、溶液中における動的な状態をも確認する必要があった。そこで私は電子スピン共鳴（ESR）法に注目した。ESRは分子中に存在する孤立電子対を観測する分光学的な手法であり、鉄硫黄クラスターなどの無機金属補因子の状態を調べるのに適している。今年度は佐賀大学の堀谷正樹助教の協力を得て、i）TtuA単体、ii）カルボキシル化TtuB存在下、iii) チオカルボキシル化TtuB存在下、iv）Na2S存在下における鉄硫黄クラスターの配位状態をEPR法を用いて測定し、それぞれに明確な違いが観測された：何も加えない場合鉄硫黄クラスターのESRスペクトルはRhombic型に対して、カルボキシル化TtuBを加えるとaxial型に変化し、さらにチオカルボキシル化TtuBおよびNa2Sを加えた時ではTtuA単体の時と異なるRhombic型のスペクトルが得られている。これらの実験結果から、鉄硫黄クラスターは結晶中だけでなく、溶液中でもリガンド分子と配位結合を形成することが確認された。現在はこれまでに得られた実験結果をまとめて、国際誌への投稿を準備している。

今年，在将丙氨酸突变全面地引入TTUA活跃部位的残基之后，我们使用HPLC进行了TTUA酶活性的实验，并使用汞凝胶进行了TTUB的脱硫实验。结果，发现将丙氨酸突变引入残基Ser55，Asp59，Asp161和Lys137中几乎或完全抑制了酶活性。根据结构信息，我们假设前三个残基参与了底物碱的腺苷酸化，并且后者一个残基参与TTUB的脱硫。从X射线晶体结构中观察到，TTUA中包含的[4FE4S]型铁硫簇可以与进入活性位点的TTUB或硫离子协调。但是，该估计的铁硫簇的功能不仅必须在晶体中，而且在溶液中的动态状态中得到证实。因此，我专注于电子自旋共振（ESR）方法。 ESR是一种光谱技术，观察到分子中存在的单电子对，适合检查无机金属辅因子（例如铁硫簇）的状态。今年，在萨加大学的助理教授Horitani Masaki的合作下，I）仅在I）中的铁硫簇的协调状态，II）在存在硫代羧化的TTUB的存在下，在使用Na2的情况下，在硫代羧化的TTUB和IV的情况下进行了epr差异，并在没有epr差异的情况下进行了测量。当添加羧化TTUB时，硫簇变为轴向类型，当添加硫代羧化的TTUB和Na2时，获得了菱形型光谱，该光谱与单独使用TTUA时不同。这些实验结果证实，铁硫簇不仅在晶体中，而且在溶液中都形成配体分子的配位键。目前，我们正在汇编迄今为止获得的实验结果，并准备将其提交给国际杂志。

项目成果

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科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

嫌気条件下での鉄硫黄タンパクの結晶化

铁硫蛋白在厌氧条件下的结晶

DOI：
发表时间：
2015
期刊：
影响因子：
0
作者：
Kadoya;S. & Tajika;E.;陳　明皓
通讯作者：
陳　明皓

Heme Binding to Porphobilinogen Deaminase from Vibrio cholerae Decelerates the Formation of 1-Hydroxymethylbilane

DOI：
10.1021/acschembio.7b00934
发表时间：
2018-03-01
期刊：
ACS CHEMICAL BIOLOGY
影响因子：
4
作者：
Uchida, Takeshi;Funamizu, Takumi;Ishimori, Koichiro
通讯作者：
Ishimori, Koichiro

Biochemical and structural characterization of oxygen-sensitive 2-thiouridine synthesis catalyzed by an iron-sulfur protein TtuA

DOI：
10.1073/pnas.1615585114
发表时间：
2017-05-09
期刊：
PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA
影响因子：
11.1
作者：
Chen, Minghao;Asai, Shin-ichi;Tanaka, Yoshikazu
通讯作者：
Tanaka, Yoshikazu

Elucidation of a novel RNA thiolation reaction mechanism involving an Fe-S cluster

阐明涉及 Fe-S 簇的新型 RNA 硫醇化反应机制

DOI：
发表时间：
2017
期刊：
影响因子：
0
作者：
Chen M;Narai S;Omura N;Shigi N;Chimnaronk S;Tanaka Y;Yao M;陳明皓;陳明皓;陳明皓;Minghao Chen;Minghao Chen
通讯作者：
Minghao Chen

バクテリアにおける二機能性ユビキチン様タンパク質の機能調節の構造基盤

细菌双功能泛素样蛋白功能调节的结构基础

DOI：
发表时间：
2016
期刊：
影响因子：
0
作者：
Asuka Matsuno;Ye Yuxin;Yuki Ohnishi;Akira Kitamura;Masataka Kinjo;Satoshi Abe;Takafumi Ueno;Yoshikazu Tanaka;Min Yao;Yoshikazu Tanaka;陳明皓，奈良井峻，大村直毅，鴫直樹，田中良和，姚閔
通讯作者：
陳明皓，奈良井峻，大村直毅，鴫直樹，田中良和，姚閔