未知補因子が関与するＲＮＡ硫黄転移機構の構造基盤

涉及未知辅因子的RNA硫转移机制的结构基础

基本信息

批准号：
15J01961
负责人：
陳明皓
金额：
$ 1.6万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2015
资助国家：
日本
起止时间：
2015-04-24 至 2018-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本年度はTtuAの活性部位周辺の残基に網羅的にアラニン変異を導入したのち、HPLCを用いてTtuAの酵素活性実験、また水銀ゲルを用いてTtuBの脱硫実験を行った。その結果、残基Ser55、Asp59、Asp161およびLys137にアラニン変異を導入すると酵素活性がほぼまたは完全に阻害されることを見出した。構造情報から、前者の3残基は基質塩基のアデニル化、後者の１残基はTtuBの脱硫反応に関与する仮説を立てた。TtuAに含まれている[4Fe4S]型鉄硫黄クラスターは、活性部位に進入するTtuBまたは硫黄イオンと配位できるとX線結晶構造より観測されている。しかし、この推定された鉄硫黄クラスターの機能は結晶中だけでなく、溶液中における動的な状態をも確認する必要があった。そこで私は電子スピン共鳴（ESR）法に注目した。ESRは分子中に存在する孤立電子対を観測する分光学的な手法であり、鉄硫黄クラスターなどの無機金属補因子の状態を調べるのに適している。今年度は佐賀大学の堀谷正樹助教の協力を得て、i）TtuA単体、ii）カルボキシル化TtuB存在下、iii) チオカルボキシル化TtuB存在下、iv）Na2S存在下における鉄硫黄クラスターの配位状態をEPR法を用いて測定し、それぞれに明確な違いが観測された：何も加えない場合鉄硫黄クラスターのESRスペクトルはRhombic型に対して、カルボキシル化TtuBを加えるとaxial型に変化し、さらにチオカルボキシル化TtuBおよびNa2Sを加えた時ではTtuA単体の時と異なるRhombic型のスペクトルが得られている。これらの実験結果から、鉄硫黄クラスターは結晶中だけでなく、溶液中でもリガンド分子と配位結合を形成することが確認された。現在はこれまでに得られた実験結果をまとめて、国際誌への投稿を準備している。

今年，在使用HPLC进行了TTUA酶活性实验，在TTUA活跃部位周围的残基引入了丙氨酸突变之后，使用汞凝胶破坏了TTUB。结果，发现将丙氨酸突变引入残基Ser55，Asp59，Asp161和Lys137几乎完全抑制或完全抑制。基于结构信息，以前的三个残基为底物碱均化，后者残基参与了TTUB的抑制反应。 X射线晶体结构观察到TTUA中包含的[4FE4S]型铁硫簇，可以用进入活性位点的TTUB或硫离子徘徊。但是，该估计的铁硫簇不仅必须在晶体中，而且在溶液中的动态状态中得到证实。因此，我专注于电子自旋共振（ESR）定律。 ESR是一种观察分子中分离的电子对的光谱方法，适合检查无机金属成分（例如铁硫簇）的状况。今年，与Saga University的Masaki Horiya助理教授合作，仅I）单独使用，ii）使用EPR方法测量的Calvoxylation ttub，iii）Thiocarboxylation ttub，iv）iv），并且没有观察到明显的差异：如果没有任何差异。补充说，当添加噻核羧基TTUB和Na2s时，将羧基化TTUB添加到龙骨类型中时，铁硫簇的ESR光谱会变为轴向类型。从这些实验结果中可以证实，铁硫簇不仅在晶体中，而且在溶液中形成配体分子和配位。目前，我们正在为迄今为止获得的实验结果总结，准备国际杂志的帖子。

项目成果

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科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

嫌気条件下での鉄硫黄タンパクの結晶化

铁硫蛋白在厌氧条件下的结晶

DOI：
发表时间：
2015
期刊：
影响因子：
0
作者：
Kadoya;S. & Tajika;E.;陳　明皓
通讯作者：
陳　明皓

Heme Binding to Porphobilinogen Deaminase from Vibrio cholerae Decelerates the Formation of 1-Hydroxymethylbilane

DOI：
10.1021/acschembio.7b00934
发表时间：
2018-03-01
期刊：
ACS CHEMICAL BIOLOGY
影响因子：
4
作者：
Uchida, Takeshi;Funamizu, Takumi;Ishimori, Koichiro
通讯作者：
Ishimori, Koichiro

Biochemical and structural characterization of oxygen-sensitive 2-thiouridine synthesis catalyzed by an iron-sulfur protein TtuA

DOI：
10.1073/pnas.1615585114
发表时间：
2017-05-09
期刊：
PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA
影响因子：
11.1
作者：
Chen, Minghao;Asai, Shin-ichi;Tanaka, Yoshikazu
通讯作者：
Tanaka, Yoshikazu

バクテリアにおける二機能性ユビキチン様タンパク質の機能調節の構造基盤

细菌双功能泛素样蛋白功能调节的结构基础

DOI：
发表时间：
2016
期刊：
影响因子：
0
作者：
Asuka Matsuno;Ye Yuxin;Yuki Ohnishi;Akira Kitamura;Masataka Kinjo;Satoshi Abe;Takafumi Ueno;Yoshikazu Tanaka;Min Yao;Yoshikazu Tanaka;陳明皓，奈良井峻，大村直毅，鴫直樹，田中良和，姚閔
通讯作者：
陳明皓，奈良井峻，大村直毅，鴫直樹，田中良和，姚閔

Elucidation of a novel RNA thiolation reaction mechanism involving an Fe-S cluster

阐明涉及 Fe-S 簇的新型 RNA 硫醇化反应机制