TNF/TNF受容体ファミリー分子の細胞内輸送機構の解明と炎症性疾患への応用

阐明TNF/TNF受体家族分子的细胞内转运机制及其在炎症性疾病中的应用

基本信息

批准号：
20790690
负责人：
三苫弘喜
金额：
$ 2.58万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2008
资助国家：
日本
起止时间：
2008 至 2009
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-20790690/
关键词：
膜型TNF 細胞内輸送内向きシグナル SNARE 細胞間移動

项目摘要

1. 膜型TNFの細胞表面への表出機構の解析 : ヒトJurkat T細胞にTNF変換酵素によって切断を受けない変異型ヒトTNFを遺伝子導入し、膜型TNFを安定して発現するヒトT細胞株を作製した。マウスのマクロファージにおいてTNFの細胞表面への表出に必須ということが報告されているSNAREファミリー分子Vamp-3を膜型TNF発現細胞に遺伝子導入し、膜型TNFの発現レベルについて検討を行った。Vamp-3を導入するとマウスのマクロファージでみられたのとは対照的に、膜型TNFの発現量はむしろ減少した二我々のこれまでの研究では、活性化T細胞やNK細胞が最も多く膜型TNFを発現し、クローン病においては病態形成にこれら活性化T細胞が重要であると考えられる。このことからヒトT細胞における膜型TNFの発現機構は重要である。少なくともマウスとヒトあるいはマクロファージとT細胞でそのメカニズムが異なることが判明したため、ヒトSNAREファミリー分子を発現ベクターに網羅的に組み込んだ。2. 膜型TNFの細胞表面表出後の挙動 : 膜型TNF発現T細胞をその標的細胞であるマクロファージと共培養を行い、その動態を観察した。T細胞上の膜型TNFはマクロファージの細胞膜上へ速やかに細胞間移動した。その方向はドナー側と同じくN末端が細胞内、C末端が細胞外となっていた。TNF受容体は1型と2型があり、1型のみあるいは2型のみを発現した細胞株を作製し、膜型TNF発現細胞と共培養した。TNF受容体1型と2型いずれも膜型TNFの細胞間移動が認められ、その程度はほぼ同等であった。この現象は膜型TNF発現細胞を4%パラホルムアルデヒドで固定することにより抑制された。局所的な細胞膜癒合が細胞間移動のメカニズムと考えられる。炎症局所では活性化リンパ球が次々と細胞-細胞間会合によりリガンドを受け渡していくことにより、炎症が促進していくことが想定された。

1、细胞表面膜型TNF表达机制分析：将不能被TNF转换酶裂解的突变型人TNF转染人Jurkat T细胞，得到稳定表达膜型TNF的人T细胞产生了菌株。我们将 SNARE 家族分子 Vamp-3 引入膜型 TNF 表达细胞中，并检测膜型 TNF 的表达水平，据报道，SNARE 家族分子 Vamp-3 对于小鼠巨噬细胞在细胞表面表达 TNF 至关重要。与在小鼠巨噬细胞中观察到的结果相反，Vamp-3 的转染实际上降低了膜型 TNF 的表达水平。2 在我们之前的研究中，活化的 T 细胞和 NK 细胞是最丰富的膜型 TNF。细胞被认为在克罗恩病的发病机制中很重要。因此，膜型TNF在人T细胞中的表达机制具有重要意义。由于发现小鼠和人类、巨噬细胞和T细胞之间的机制不同，我们将人类SNARE家族分子全面整合到表达载体中。 2.细胞表面表达膜型TNF后的行为：将表达膜型TNF的T细胞与其靶细胞巨噬细胞共培养，观察其动态。 T细胞上的膜型TNF迅速移动到巨噬细胞的细胞膜上。方向与供体侧相同，N端在细胞内，C端在细胞外。 TNF 受体有两种类型：1 型和 2 型。创建仅表达 1 型或 2 型的细胞系，并与表达膜型 TNF 的细胞共培养。对于1型和2型TNF受体均观察到膜型TNF的细胞间运动，并且运动的程度大致相同。用 4% 多聚甲醛固定表达 TNF 的膜型细胞可抑制这种现象。局部细胞膜融合被认为是细胞间运动的机制。据推测，活化的淋巴细胞通过发炎区域的细胞间关联连续转移配体，从而促进炎症。