シャペロニンの変性蛋白質「閉じ込め」と反応サイクルの1分子解析

伴侣蛋白变性蛋白质“限制”和反应循环的单分子分析

基本信息

批准号：
08J07008
负责人：
野島達也
金额：
$ 0.77万
依托单位：
Tokyo Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2008
资助国家：
日本
起止时间：
2008 至 2009
项目状态：
已结题

项目摘要

GroELは変性蛋白質を結合し、ATPと補助蛋白質GroESの結合に伴い変性蛋白質をGroEL/ES複合体内部の空洞に閉じ込め、変性蛋白室のフォールディングを補助する。SBPと呼ばれるGroELに強く結合するペプチドをGFPに融合すると、GroEL/ES複合体への閉じ込めが遅くなることをこれまでに見出した。GroELの反応サイクルには2個の律速過程が存在し、最初の過程が変性タンパク質の閉じ込めに対応する。SBP融合GFPを用いて変性蛋白室の閉じ込め過程が遅くなった場合の、GroELの反応サイクルへの影響を一分子観察により調べることを本研究の目的とした。SBP融合GFP存在下で、GroELとGroESとの結合解離の一分観察実験を行ったが、律速過程の延長は観察されなかった。これは変性タンパク質の閉じ込めと、GroEL/ESの持つ律速過程が厳密にカップルしていないことを意味した。本研究の実験系はGroELの持つ2つのリング構造の一方にGroESが結合した「弾丸型複合体」を中心とした反応モデルをもとに組み立てられていた。本研究のさなか、両方のリングにGroESが結合した「フットボール型複合体」が反応サイクルを考える上で無視できない存在であることが他のグループから報告された。そこで、GroELの構造変化をサブユニット間ジスルフィド結合により検出する変異体を作成し、ヌクレオチド条件等との関連を検討した。結果、GroELはATP存在下では両方のリングが構造変化することが明らかとなった。そして、構造変化に続くGroESの両方のリングへの結合によって、フットボール型GroEL/ES複合体が形成されることを明らかにした。ヌクレオチド条件とGroELの構造変化の関連と、フットボール型複合体の形成条件を解明したこの結果をJournal of Biological chemistry誌に報告した。

GroEL与变性蛋白结合，通过ATP与辅助蛋白GroES的结合将变性蛋白捕获在GroEL/ES复合物内部的空腔中，并协助变性蛋白室的折叠。我们之前发现，将一种名为 SBP 的肽（它与 GroEL 强烈结合）与 GFP 融合，可以减缓其在 GroEL/ES 复合物中的限制。 GroEL 反应循环中有两个限速步骤，第一个对应于变性蛋白质的捕获。本研究的目的是通过单分子观察，研究当使用 SBP 融合 GFP 减慢变性蛋白室的限制过程时对 GroEL 反应周期的影响。在 SBP 融合 GFP 存在的情况下，对 GroEL 和 GroES 之间的结合和解离进行一分钟的观察实验，但没有观察到限速过程的延长。这意味着变性蛋白质的限制和 GroEL/ES 的限速过程并不严格耦合。本研究的实验系统是基于以“子弹形复合物”为中心的反应模型组装的，其中 GroES 与 GroEL 的两个环结构之一结合。在这项研究中，其他小组报告说，在考虑反应循环时，GroES 与两个环结合的“足球形复合物”是一个不可忽视的实体。因此，我们创建了通过亚基间二硫键检测 GroEL 结构变化的突变体，并研究了其与核苷酸条件的关系。结果表明，GroEL 的两个环在 ATP 存在下都会发生结构变化。他们发现，足球形状的 GroEL/ES 复合物是通过结构变化后 GroES 与两个环结合而形成的。这项研究的结果阐明了 GroEL 中核苷酸条件和结构变化之间的关系以及足球形复合物的形成条件，该结果发表在《生物化学杂志》上。