クライオ電子顕微鏡を用いたダイニン-微小管複合体の構造解析

使用冷冻电子显微镜对动力蛋白-微管复合物进行结构分析

基本信息

批准号：
08J00020
负责人：
小田賢幸
金额：
$ 0.77万
依托单位：
Kyoto University (2009)The University of Tokyo (2008)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2008
资助国家：
日本
起止时间：
2008 至 2009
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08J00020/
关键词：
ダイニンクライオ電子顕微鏡構造解析鞭毛微小管 ATP Mass Spectrometry

项目摘要

植物プランクトンであるクラミドモナスから鞭毛を回収し、その運動を司るタンパク質である鞭毛ダイニンの構造解析を行っている。鞭毛ダイニンは微小管を構成するタンパク質であるチューブリンと共重合する性質があり、それにより生成されたダイニン-微小管複合体が私の研究の主要な試料である。ダイニンは2MDaある巨大なATPaseであり、我々の研究によりATP依存的な構造変化を起こすことが明らかになっている(Oda et al.2007)。この構造変化をさらに詳細に解析することが本年度の研究テーマである。1.ATPase活性部位のマッピング電子顕微鏡の実験において、ラベルされた部位が本当に想定されているドメインであることを生化学的に検証するため、アジド化されたATPおよびADPを用いてダイニンとヌクレオチドを紫外線により共有結合させた。そのダイニンをトリプシンで分解し、固相化されたストレプトアビジンを用いてビオチン化ペプチドを精製した。TOF-Mass解析により二つのシグナルを得た。このシグナルは再現性があり、ATPおよびADP両方から同様に検出されている。これにより電顕像でラベルされている部位はATPとADPでは同じであると確認できた。現在、ラベル部位の正確な同定をfinger printingによって試みている。2.電子トモグラフィーネガティブステイニング法を用いてストークドメインのATP依存的構造変化を観察している。モリブデンを染色剤に使用し、サンプルをトレハロースアモルファス膜に包埋することにより高いコントラストを得ること成功した。国立神経精神センターの諸根室長との共同研究により、高傾斜かつ多サンプルのトモグラムを撮影した。通常のback-projection法からある程度ストーク像を観察することができた。

我们从浮游植物衣藻中收集了鞭毛，并对鞭毛动力蛋白（一种控制其运动的蛋白质）进行了结构分析。鞭毛动力蛋白具有与微管蛋白（一种构成微管的蛋白质）共聚的特性，所产生的动力蛋白-微管复合物是我研究的主要样本。动力蛋白是一种大小为 2 MDa 的大型 ATP 酶，我们的研究表明它会经历 ATP 依赖性结构变化 (Oda et al. 2007)。今年的研究主题是更详细地分析这种结构性变化。 1. ATP酶活性位点的定位为了在电镜实验中从生化角度验证标记位点确实是预期的结构域，我们使用叠氮化的ATP和ADP通过紫外光实现了连接动力蛋白和核苷酸。用胰蛋白酶消化动力蛋白，并使用固定化链霉亲和素纯化生物素化肽。通过TOF-质量分析获得两个信号。该信号是可重复的，并且可从 ATP 和 ADP 中进行类似的检测。这证实了电子显微镜图像中标记的 ATP 和 ADP 区域是相同的。我们目前正在尝试使用指纹来准确识别标签位置。 2.利用电子断层扫描负染色法观察茎域ATP依赖性结构变化。我们通过使用钼作为染色剂并将样品嵌入海藻糖无定形膜中，成功获得了高对比度。通过与国家神经病学和精神病学中心莫罗内主任的联合研究，我们获得了高斜率、多样本断层图。我们能够使用普通的反投影方法在一定程度上观察斯托克斯图像。