クロマチンタンパク質のユビキチン修飾を介した維持ＤＮＡメチル化制御機構の解析

染色质蛋白泛素修饰介导的维持DNA甲基化控制机制分析

基本信息

批准号：
14J07515
负责人：
山口留奈
金额：
$ 1.79万
依托单位：
Nagoya City University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2014
资助国家：
日本
起止时间：
2014-04-25 至 2017-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-14J07515/
关键词：
DNAメチル化 DNA複製クロマチン Dnmt1 Uhrf1 Usp7 ユビキチン化ユビキチン

项目摘要

DNAのメチル化は、エピジェネティック情報の一つとして細胞固有の遺伝子発現や形質制御に重要であり、個体の正常な発生や細胞分化に関与する。本研究では、維持メチル化の過程でUhrf1依存的に生じるヒストンH3のユビキチン化/脱ユビキチン化制御の分子機構の解明および細胞の生存に与える影響を明らかにすることを目的とする。DNAのメチル化パターンはDNA複製を介して親鎖から娘鎖へと、メチル化酵素Dnmt1により正確に継承される必要がある。我々はこれまでにアフリカツメガエル卵を用いた無細胞系での解析により、ヘミメチル化DNA結合タンパク質Uhrf1によるH3K23のユビキチン化が、Dnmt1の同部位への集積に重要であることを報告してきた。またDNA複製の完了に伴い、Dnmt1のクロマチンからの解離とともにH3の脱ユビキチン化が起こることが分かっているが、この詳細は不明である。H3の脱ユビキチン化がDnmt1の解離とともに起こることに注目し、卵抽出液を用いてDnmt1に結合する脱ユビキチン化酵素を質量分析にて探索したところUsp7を同定した。そこでUsp7のクロマチン結合を調べると、複製依存的かつDnmt1およびUhrf1依存的に結合することが分かった。興味深いことに、Usp7を卵抽出液より特異抗体を用いて免疫除去したとき、Dnmt1のクロマチン結合の増強およびH3の弱いユビキチン化が見られた。続いてin vitroの脱ユビキチン化アッセイにより、Usp7が直接ヒストンH3を脱ユビキチン化する活性について検討したところ、加えたリコンビナントUsp7の濃度依存的にH3のユビキチン化の減少が見られた。またUsp7阻害剤で抽出液を処理したところ、DNAメチル化がコントロールに比べ大きく抑制されることを見出した。

DNA甲基化作为细胞特异性基因表达和性状控制的一种重要表观遗传信息，参与个体的正常发育和细胞分化。本研究的目的是阐明维持甲基化过程中 Uhrf1 依赖的组蛋白 H3 泛素化/去泛素化调节的分子机制及其对细胞存活的影响。 DNA 甲基化模式必须通过甲基转移酶 Dnmt1 的 DNA 复制从亲本链准确遗传到子链。通过使用非洲爪蟾卵进行无细胞分析，我们之前报道过半甲基化 DNA 结合蛋白 Uhrf1 对 H3K23 的泛素化对于 Dnmt1 在同一位点的积累非常重要。还已知 DNA 复制完成后，Dnmt1 从染色质解离，并且发生 H3 去泛素化，但其细节尚不清楚。注意到 H3 的去泛素化伴随着 Dnmt1 的解离而发生，我们使用鸡蛋提取物通过质谱法寻找与 Dnmt1 结合的去泛素化酶，并鉴定了 Usp7。当我们研究 Usp7 的染色质结合时，我们发现它以复制依赖性方式以及 Dnmt1 和 Uhrf1 依赖性方式结合。有趣的是，当使用特异性抗体从鸡蛋提取物中免疫去除 Usp7 时，观察到 Dnmt1 的染色质结合增强和 H3 的泛素化较弱。接下来，我们使用体外去泛素化测定检测了Usp7直接去泛素化组蛋白H3的活性，发现H3泛素化以添加的重组Usp7的浓度依赖性方式降低。此外，当用Usp7抑制剂处理提取物时，发现与对照相比，DNA甲基化被显着抑制。

项目成果

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Usp7-dependent histone H3 deubiquitylation regulates maintenance of DNA methylation.

DOI：
10.1038/s41598-017-00136-5
发表时间：
2017-03-03
期刊：
Scientific reports
影响因子：
4.6
作者：
Yamaguchi L;Nishiyama A;Misaki T;Johmura Y;Ueda J;Arita K;Nagao K;Obuse C;Nakanishi M
通讯作者：
Nakanishi M

Reguation of DNA methylation-coupled histone H3 deubiquitylation

DNA 甲基化偶联组蛋白 H3 去泛素化的调控