Ｄａｘ１を介したＥＳ細胞の自己複製維持機構の解析

Dax1介导的ES细胞自我更新维持机制分析

基本信息

批准号：
14J06649
负责人：
浦西洸介
金额：
$ 1.6万
依托单位：
Kanazawa University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2014
资助国家：
日本
起止时间：
2014-04-25 至 2016-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-14J06649/
关键词：
ES細胞 Dax1 Esrrb Ncoa3 Gata6 T

项目摘要

マウスES細胞において、核内受容体Dax1はOct3/4を中心とする転写因子ネットワークに属しており、自己複製維持において何等かの役割を果たしていると考えられる。本研究ではES細胞におけるDax1を介した自己複製維持機構の解析を行った。4HT添加によってDax1遺伝子をノックアウトできるコンディショナルノックアウトES細胞株を樹立し、遺伝子発現を確認したところ、ノックアウト２日では分化マーカーの遺伝子変化は見られなかったが、ノックアウト７日の細胞では内胚葉系マーカーであるGata6とTの発現の上昇が見られた。申請者は以前、EsrrbとDax1の相互作用を阻害すると内胚葉系マーカー遺伝子の上昇を確認しているため、Dax1のノックアウト時のGata6の発現上昇もEsrrbが何らかの関与をしていると考え、EsrrbのGata6の発現に対する作用を検証した。Gata6のプロモーター領域を用いてLuciferaseレポーターアッセイやChIPアッセイを行ったところ、EsrrbはGata6のプロモーター上にあるEsrrb結合配列に直接結合し、Gata6プロモーターの転写活性を上昇させていることが明らかになった。また、ES細胞において、Esrrbはco-activatorであるNcoa3と相互作用することが知られているため、Gata6プロモーターに対するNcoa3の作用を検証したところ、Ncoa3によってもGata6のプロモーター活性が上昇することが明らかとなった。このNcoa3によるGata6プロモーター活性の上昇は、Esrrbに結合できないDax1の変異体で抑制されたため、Dax1とNcoa3の相互作用を確認したところ、Dax1とNcoa3は直接結合できることが明らかとなった。以上のことから、Dax1はEsrrbだけではなく、Esrrbのco-activatorであるNcoa3も抑制することによってGata6プロモーターの活性を抑制することによりES細胞の自己複製維持に貢献していることが明らかになった。

在小鼠ES细胞中，核受体DAX1属于以OCT3/4左右为中心的转录因子网络，被认为在维持自我更新中起着一定作用。在这项研究中，我们分析了通过ES细胞中DAX1维持自我更新的机制。当建立有条件的敲除ES细胞系，该细胞系可以通过添加4HT敲除DAX1基因并确认基因表达时，在2天的分化标记中未观察到基因的变化，但是敲除的7天时的细胞显示GATA6和T的表达增加，这是内胚层标记的。申请人先前在抑制ESRRB和DAX1之间的相互作用时证实了内胚层标记基因的增加，因此，申请人认为ESRRB在DAX1敲除时GATA6的表达有所参与，并检查了ESRRB对GATA66表达的作用。当使用GATA6的启动子区域进行荧光素酶报告基因测定和芯片测定时，据表明，ESRRB直接与GATA6启动子上的ESRRB结合序列结合，从而增加了GATA6启动子的转录活性。此外，由于已知ESRRB与ES细胞中的共激活剂NCOA3相互作用，因此我们验证了NCOA3对GATA6启动子的影响，并且发现NCOA3还增加了GATA6的启动子活性。 NCOA3的GATA6启动子活性的增加被DAX1的突变体抑制了无法与ESRRB结合的突变体，当我们确认DAX1和NCOA3之间的相互作用时，揭示了DAX1和NCOA3可以直接结合。从上面可以揭示出DAX1不仅通过抑制ESRRB，还可以抑制ESRRB的共激活剂NCOA3来促进ES细胞的自我更新，从而抑制GATA6启动子的活性。