Ｄａｘ１を介したＥＳ細胞の自己複製維持機構の解析

Dax1介导的ES细胞自我更新维持机制分析

基本信息

批准号：
14J06649
负责人：
浦西洸介
金额：
$ 1.6万
依托单位：
Kanazawa University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2014
资助国家：
日本
起止时间：
2014-04-25 至 2016-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-14J06649/
关键词：
ES細胞 Dax1 Esrrb Ncoa3 Gata6 T

项目摘要

マウスES細胞において、核内受容体Dax1はOct3/4を中心とする転写因子ネットワークに属しており、自己複製維持において何等かの役割を果たしていると考えられる。本研究ではES細胞におけるDax1を介した自己複製維持機構の解析を行った。4HT添加によってDax1遺伝子をノックアウトできるコンディショナルノックアウトES細胞株を樹立し、遺伝子発現を確認したところ、ノックアウト２日では分化マーカーの遺伝子変化は見られなかったが、ノックアウト７日の細胞では内胚葉系マーカーであるGata6とTの発現の上昇が見られた。申請者は以前、EsrrbとDax1の相互作用を阻害すると内胚葉系マーカー遺伝子の上昇を確認しているため、Dax1のノックアウト時のGata6の発現上昇もEsrrbが何らかの関与をしていると考え、EsrrbのGata6の発現に対する作用を検証した。Gata6のプロモーター領域を用いてLuciferaseレポーターアッセイやChIPアッセイを行ったところ、EsrrbはGata6のプロモーター上にあるEsrrb結合配列に直接結合し、Gata6プロモーターの転写活性を上昇させていることが明らかになった。また、ES細胞において、Esrrbはco-activatorであるNcoa3と相互作用することが知られているため、Gata6プロモーターに対するNcoa3の作用を検証したところ、Ncoa3によってもGata6のプロモーター活性が上昇することが明らかとなった。このNcoa3によるGata6プロモーター活性の上昇は、Esrrbに結合できないDax1の変異体で抑制されたため、Dax1とNcoa3の相互作用を確認したところ、Dax1とNcoa3は直接結合できることが明らかとなった。以上のことから、Dax1はEsrrbだけではなく、Esrrbのco-activatorであるNcoa3も抑制することによってGata6プロモーターの活性を抑制することによりES細胞の自己複製維持に貢献していることが明らかになった。

在小鼠 ES 细胞中，核受体 Dax1 属于以 Oct3/4 为中心的转录因子网络，被认为在维持自我更新方面发挥一定作用。在本研究中，我们分析了 ES 细胞中 Dax1 介导的自我更新维持机制。当我们建立条件敲除ES细胞系，其中通过添加4HT可以敲除Dax1基因并确认基因表达时，我们发现敲除后2天没有观察到分化标记物的遗传变化，但在敲除后7天的细胞中观察到分化标记物的遗传变化。敲除后，建立了内胚层谱系，观察到标记物 Gata6 和 T 的表达增加。申请人之前证实抑制Esrrb和Dax1之间的相互作用会导致内胚层标记基因的增加，因此我们认为Esrrb在某种程度上参与了Dax1敲除后Gata6表达的增加，我们验证了Gata6对Gata6表达的影响。。使用 Gata6 启动子区域的荧光素酶报告基因测定和 ChIP 测定表明，Esrrb 直接与 Gata6 启动子上的 Esrrb 结合序列结合，并增加 Gata6 启动子的转录活性。此外，在ES细胞中，已知Esrrb与共激活剂Ncoa3相互作用，因此当我们验证Ncoa3对Gata6启动子的作用时，我们发现Ncoa3也增加了Gata6启动子的活性。 Ncoa3 引起的 Gata6 启动子活性的增加被无法与 Esrrb 结合的 Dax1 突变体抑制，因此当我们确认 Dax1 和 Ncoa3 之间的相互作用时，很明显 Dax1 和 Ncoa3 可以直接结合。由上可知，Dax1不仅抑制Esrrb，还抑制Esrrb Ta的共激活因子Ncoa3，从而抑制Gata6启动子的活性，从而有助于维持ES细胞的自我更新。