糖鎖量子ドットを用いた蛍光イメージング法によるゴルジ体酵素の１分子キネティクス

使用聚糖量子点进行荧光成像的高尔基体酶的单分子动力学

• 批准号: 24710241
• 负责人: 長堀 紀子
• 金额: $ 3万
• 依托单位: Hokkaido University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2012
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2012-04-01 至 2013-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-24710241/
• 关键词: 糖転移酵素; 1分子イメージング; 量子ドット; ゴルジ体; 全反射蛍光顕微鏡; Glyconanoparticle

糖脂質合成を担うシアル酸転移酵素である SiaT1 は、ゴルジ膜上で GalT1 および Sia2とヘテロダイマーを形成することが知られている。この3種類の糖転移酵素について異なる蛍光タンパク質でラベル化し、1分子蛍光顕微鏡を用いた解析行うことで、GalT(モノマー)、GalT1(ホモ)、 GalT1-SiaT(ヘテロ)、SiaT1(モノマー)、SiaT1(ホモ)、SiaT1-SiaT2(ヘテロ)、SiaT2(モノマー)、 SiaT2(ホモ)について、それぞれの酵素複合体を1分子ずつ(複合体をひとつずつ)区別して解析することを目的として実験を開始した。<糖鎖量子ドット作製方法の改良>糖鎖量子ドットより簡単に作製できるように、作製手順･方法についての条件検討を行った。<蛍光ラベルした糖転移酵素遺伝子の作製>WT-MEFおよびSiaT1-KO MEFについて、その糖脂質および糖タンパク質発現プロファイル解析を行ったところ、WT-MEFではいずれの標的糖転移酵素も発現していることが支持された。SiaT1は糖脂質を基質として作用し、糖タンパク質（N-グリカン）には反応しないにもかかわらず、糖タンパク質糖鎖プロファイルに顕著な変化が観察された。この糖鎖解析方法および観察された現象については、論文として報告済みである。次に、WT MEFよりmRNAを抽出し、逆転写反応によって得られたDNA混合物をテンプレートして、各標的糖転移酵素に対応するプライマーを用いてPCR反応を行い、各糖転移酵素遺伝子のクローニングを行った。反応条件検討およびシーケンス確認の結果、３種の標的遺伝子のうち、SiaT1,SiaT2については正しい配列の遺伝子を得られた。現在GalTについての反応条件の最適化およびシーケンス確認を行うと共に、蛍光タンパク質との融合タンパク質を生成するための遺伝子を作製中である。

SiaT1 是一种负责糖脂合成的唾液酸转移酶，已知它与高尔基体膜上的 GalT1 和 Sia2 形成异二聚体。通过用不同的荧光蛋白标记这三种类型的糖基转移酶并使用单分子荧光显微镜对其进行分析，我们发现GalT（单体）、GalT1（同源）、GalT1-SiaT（异源）、SiaT1（单体）和SiaT1（同型）、SiaT1-SiaT2（异型）、SiaT2（单体）、对于 SiaT2（同源），我们开始了一项实验，目的是一次区分和分析每个酶复合物的一个分子（一次一个复合物）。 <糖链量子点的制造方法的改进> 我们研究了制造工序和方法的条件，以便比糖链量子点更容易制造。 <荧光标记糖基转移酶基因的制备> 对WT-MEF和SiaT1-KO MEF的糖脂和糖蛋白表达谱的分析表明，两种目标糖基转移酶均在WT-MEF中表达。尽管 SiaT1 以糖脂为底物起作用，并且不与糖蛋白（N-聚糖）发生反应，但观察到糖蛋白聚糖谱的显着变化。这种糖链分析方法和观察到的现象已经在论文中报道过。接下来，我们从WT MEF中提取mRNA，使用逆转录获得的DNA混合物作为模板，并使用与每个目标糖基转移酶相对应的引物进行PCR反应以克隆每个糖基转移酶基因。通过检查反应条件和确认序列，在三个目标基因中，获得了SiaT1和SiaT2具有正确序列的基因。我们目前正在优化反应条件并确认 GalT 的序列，以及创建用于生产带有荧光蛋白的融合蛋白的基因。

项目成果

シングルレーザー蛍光相互相関分光法による糖鎖提示ナノ微粒子の相互作用解析

使用单激光荧光互相关光谱分析聚糖呈递纳米颗粒的相互作用

• 发表时间: 2012
• 作者: 長堀 紀子