病原菌に存在するヘム分解酵素が有する鉄獲得とは異なる新たな生理機能

病原菌中存在的血红素降解酶具有不同于铁获取的新生理功能

基本信息

批准号：
18J10820
负责人：
道順暢彦
金额：
$ 0.96万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2018
资助国家：
日本
起止时间：
2018-04-25 至 2020-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究は病原菌に存在するヘム分解酵素によって生じたヘムの分解産物であるビリベルジンに注目し、その生理機能を分子進化の過程から明らかにすることを目的としている。ビリベルジンを光合成の出発原料に利用するシアノバクテリアには、機能不明のタンパク質Alr5027が存在し、これは代表的な病原菌であるコレラ菌に存在するヘム分解酵素HutZの相同体である。アミノ酸の相同性より系統樹ではAlr5027と他の細菌類を含めたHutZとで枝の分岐を示していた。さらにAlr5027とHutZの配列を比較すると、Alr5027ではヘム分解反応に必要であるArg、Aspは保存されてたものの、ヘムの結合に必要な軸配位子のHisが保存されておらず、Lys164となっていた。したがって、HutZ型ヘム分解酵素を持つ病原菌は進化の過程でAlr5027を改変することでヘム分解酵素を獲得したと考え、分子進化を通しヘム分解酵素の生理機能を検討するためAlr5027のヘムの分解機能の付加を試みた。ヘムと結合するのかを紫外可視吸収スペクトルを用いて検討したところ、ヘムとの結合は観測されなかった。そこでLys164をHisに置換した変異体（K164H）を作成したところヘムとの結合が観測された。この変異体がヘムの分解反応を行うのかを検討するため、過酸化水素を加えヘム分解反応を観測すると、ヘム分解酵素のみで観測される反応中間体ベルドヘムの生成を確認した。Hisを挿入する位置をN末端側、C末端にそれぞれ一残基ずらしても、ヘムの結合が観測されず、ベルドヘムの生成量が著しく少なかったので、Lys164の位置にHisを置換することがAlr5027のヘム分解活性の獲得には最適であった。以上より、Lys164をHisに変異しただけでAlr5027にはヘムが結合し、ヘムの自己酸化反応であるヘム分解反応の機能を付加することに成功した。

本研究重点关注病原菌中存在的血红素降解酶产生的血红素降解产物胆绿素，旨在从分子进化过程中阐明其生理功能。蓝细菌利用胆绿素作为光合作用的起始材料，含有一种功能未知的蛋白质 Alr5027，它是典型病原菌霍乱弧菌中血红素降解酶 HutZ 的同源物。基于氨基酸同源性，系统发育树显示 Alr5027 和 HutZ 之间的分支，其中包括其他细菌。此外，当比较Alr5027和HutZ的序列时，发现虽然血红素分解反应必需的Arg和Asp在Alr5027中保守，但血红素结合必需的轴向配体His不保守， Lys164 和它已经成为。因此，我们认为具有HutZ型血红素降解酶的病原菌是在进化过程中通过修饰Alr5027获得了血红素降解酶。当使用紫外可见吸收光谱检查其是否与血红素结合时，没有观察到与血红素的结合。因此，我们创建了一个突变体（K164H），其中Lys164被His取代，并观察到与血红素的结合。为了研究该突变体是否会进行血红素分解反应，我们添加过氧化氢并观察血红素分解反应，发现产生了只有血红素降解酶才能观察到的反应中间体verdeheme。即使His的插入位置向N末端和C末端移动1个残基，也没有观察到血红素结合，并且产生的verdeheme的量也明显较少，因此，建议将Alr5027的Lys164位置处的His替换。它对于获得血红素降解活性是最佳的。如上所述，仅通过将Lys164突变为His，血红素就与Alr5027结合，并且我们成功地添加了血红素分解反应的功能，该反应是血红素的自动氧化反应。