HeLa細胞における微小管結合タンパク質ダイナミン2の機能解析

HeLa 细胞微管相关蛋白 dynamin 2 的功能分析

基本信息

批准号：
12J07069
负责人：
森田真規子
金额：
$ 0.58万
依托单位：
Hiroshima University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2012
资助国家：
日本
起止时间：
2012 至 2013
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12J07069/
关键词：
ダイナミン2 微小管微小管ダイナミクス GTPase活性

项目摘要

本研究は、ダイナミン2が微小管結合タンパク質として細胞内でどのような機能を担っているか明らかにする事を目的としている。そこで、先行研究で発見した微小管共局在型変異体Dyn-2-(1-786)を用い、(1)細胞内でDyn-2-(1-786)はどのように微小管と相互作用しているか、(2)Dyr2-(1-786)が微小管と相互作用する事による生理的意義について、細胞生物学的手法および生化学的手法により解析した。(1)細胞内におけるDyn-2-(1-786)と微小管の相互作用の機構について間期のHeLa細胞内にGFP-Dyn-2-(1-786)およびEB3-RFPを共発現させ、これらのタンパク質の挙動を共焦点顕微鏡や全反射顕微鏡を用いてライブイメージング解析を行った。その結果、二者は同速度・同方向に移動するが、直接的な相互作用はしていない事を明らかにした。(2-1)生理的意義について(細胞生物学的手法)間期のGFP-Dyn-2-(1-786)発現細胞にダイナミン2のGTPase活性阻害剤を作用させた解析から、ダイナミン2のGTPase活性が微小管伸張の制御に関与している事を明らかにした。また、微小管安定化剤を用いた解析から、ダイナミン2と微小管の相互作用は微小管ダイナミクスに依存している事を明らかにした。(2-2)生理的意義について(生化学的手法)間期および分裂期のHeLa細胞粗抽出液を用いて、微小管安定化剤存在下・非存在下におけるダイナミン2と微小管の結合の有無について検討を行った。その結果、間期では、微小管安定化剤非存在下に比べ、存在下では微小管画分中に沈降するダイナミン量が減少する事が明らかにした。この事実は、(2-1)で明らかにした結果と一致する。一方、分裂期では、微小管安定化剤の存在に関わらず、微小管画分中にダイナミンが沈降している事を明らかにした。これらの事実から、間期および分裂期では、それぞれ異なる機構でダイナミンと微小管が相互作用している可能性を明らかにした。

本研究的目的是阐明细胞中 dynamin 2 作为微管结合蛋白的作用。因此，我们利用前期研究中发现的微管共定位突变体Dyn-2-(1-786)来研究(1)Dyn-2-(1-786)如何与细胞中的微管相互作用；(2)Dyn-2-(1-786)的生理意义；使用细胞生物学和生化方法分析了 Dyr2-(1-786) 与微管的相互作用。 (1)关于Dyn-2-(1-786)与细胞内微管的相互作用机制，我们在间期HeLa细胞中共表达GFP-Dyn-2-(1-786)和EB3-RFP，并进行了活体成像分析。使用共焦显微镜和全内反射显微镜观察这些蛋白质的行为。结果显示，虽然两者以相同的速度和相同的方向移动，但它们并不直接相互作用。 (2-1)生理意义(细胞生物学方法) 通过对用dynamin 2 GTPase活性抑制剂dynamin 2处理的间期GFP-Dyn-2-(1-786)表达细胞的分析可知，GTPase活性参与控制微管伸长。此外，使用微管稳定剂的分析表明，dynamin 2 和微管之间的相互作用取决于微管动力学。 (2-2)生理意义(生物化学方法) 使用间期和有丝分裂HeLa细胞的粗提取物，我们研究了在存在和不存在微管稳定剂的情况下动力蛋白2和微管之间的关系。我们考虑是否是这种情况。结果表明，在分裂间期，与不存在微管稳定剂相比，存在微管稳定剂的情况下，微管部分中沉淀的动力蛋白量减少。这一事实与(2-1)中揭示的结果一致。另一方面，在有丝分裂阶段，无论是否存在微管稳定剂，动力蛋白都被发现沉淀在微管部分中。这些事实揭示了动力和微管在间期和有丝分裂期间通过不同机制相互作用的可能性。