精子における転写産物の総合的解析

精子转录本的综合分析

基本信息

批准号：
19870035
负责人：
川野光興
金额：
$ 2万
依托单位：
The Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (Start-up)
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2008
项目状态：
已结题

项目摘要

精子では転写が行われていないため、今まで精子を用いた大規模なcDNA配列解析はなされていない。しかし最近の報告により、精子内にもRNAが存在していることが明らかになった。よって本研究では、精子中に存在する転写産物の網羅的同定を塩基配列決定により行い、新規の機能性RNA分子を探索することを目的とした。精子は体細胞とは異なり全体的に非常に凝集したクロマチン構造をとっている。そのような状況下において存在しているRNAの生理機能を解析することにより、精子における遺伝子サイレンシングやゲノム構造の維持機構に関する理解を深められる。これらのデータは、RNAが遺伝物質として機能するという仮説の上に立った候補RNAを探索する基礎データにもなりうると考えられる。今年度の具体的な研究内容を以下に述べる。始めにマウスおよびチンパンジーから運動能力のある精子を採取して全RNAを精製した。今回の解析では、小分子RNAを含むできるだけ多くの転写産物の同定を行えるようにするため、RNAの長さおよび末端の形状に依存しない両末端タグ法を用いてcDNAを調整した。454シークエンサーを用いてcDNAの塩基配列決定を行い、マウスは約45万、チンパンジーは約5万のcDNAタグを得た。生物情報学的解析により、cDNAのゲノムへのマッピングを行いRNAの分類をした。その結果、マウスおよびチンパンジーの精子中にはrRNA、tRNA、mRNAの断片やmiRNA、piRNA、snoRNAなどの機能性RNAが存在することを明らかにすることができた。mRNAとmiRNAの幾つかのものについては、実際に精子中にRNAが存在することをTaqMan qRT-PCR法を用いて確認した。さらに、マウスの精子から新規miRNAの候補を複数同定した。今後は、マウスとチンパンジーの精子RNAプロファイルを比較解析する。

由于精子中不发生转录，因此迄今为止尚未使用精子进行大规模 cDNA 序列分析。然而，最近的报道表明，RNA也存在于精子中。因此，本研究的目的是通过碱基测序全面鉴定精子中存在的转录本，并寻找新的功能性RNA分子。与体细胞不同，精子具有整体高度聚集的染色质结构。通过分析这种条件下存在的RNA的生理功能，我们可以加深对精子中基因沉默和基因组结构维持机制的理解。这些数据还可以作为基于RNA作为遗传物质的假设寻找候选RNA的基础数据。现将今年的具体研究内容介绍如下。首先，从小鼠和黑猩猩中收集活动精子并纯化总 RNA。在此分析中，为了鉴定尽可能多的转录本，包括小RNA，使用独立于RNA长度和末端形状的双末端标记方法制备cDNA。使用454测序仪对cDNA进行测序，获得了大约450,000个小鼠的cDNA标签和大约50,000个黑猩猩的cDNA标签。通过生物信息分析，将cDNA映射到基因组，并对RNA进行分类。结果表明，小鼠和黑猩猩的精子中存在rRNA、tRNA、mRNA片段、miRNA、piRNA和snoRNA等功能性RNA。使用 TaqMan qRT-PCR 方法证实了精子中某些 mRNA 和 miRNA 的存在。此外，我们在小鼠精子中发现了多种新的 miRNA 候选物。未来，我们将对小鼠和黑猩猩的精子RNA谱进行比较分析。