Study on structures, functions and applications of novel endo-type and exo-type glycoceramidases involved in glycosphingolipid metabolism

鞘糖脂代谢中新型内切型和外切型神经酰胺酶的结构、功能及应用研究

基本信息

批准号：
19380061
负责人：
ITO Makoto
金额：
$ 12.9万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2008
项目状态：
已结题

项目摘要

スフィンゴ脂質は、形質膜ミクロドメインに主として存在し、細胞内のシグナリングや細胞間の相互作用に重要な役割を演じている。本研究では、申請者らが発見した非リソソーム性スフィンゴ脂質代謝酵素の構造と機能について研究を行い、以下のような成果を上げた。先ず、哺乳動物の細胞質に存在するグルコシルセラミド(GlcCer)分解酵素(エキソ型グリコセラミダーゼ)をクローニングした。本酵素は、老化関連タンパク質クロトーのホモログ(KLrP)であった。本酵素の活性をRNAi で抑制すると、細胞内のGlcCer 量およびGlcCer骨格を持つ糖脂質量が減少することを見出し、KLrPが細胞の糖脂質代謝に関わっていることを示した。本酵素を大腸菌で大量に発現させ、グルコース及びガラクトースとの共結晶を作製し、X線結晶構造解析を行った。その結果、KLrPはαヘリックスとβストランドを8回繰り返す、典型的なTIMバレル構造を示すこと、β-ストランド4および7のC 末に存在するE165とE373がそれぞれ酸/塩基触媒残基、求核残基であることを証明した。また、本研究においてリソソーム性の中性セラミダーゼの結晶構造解析に初めて成功した。その構造は今までに報告のない新しいものであり、その触媒機構は亜鉛を触媒中心とすることを明らかにした。構造を解くことで、スフィンゴ脂質シグナリングや食餌由来のセラミドの代謝・消化への関与等、本酵素の多彩な機能が合理的に説明できた。一方、放線菌から単離したエンド型グリコセラミダーゼ(EGALC)の基質特異性を詳細に調べ、本酵素は6ガラ系列糖脂質に特異的に作用することを明らかにした。また、EGALC は加水分解のみならず糖鎖の転移反応も効率よく触媒することも明らかになった。この特異性を利用した、6-ガラ系列糖脂質の蛍光標識法及び微量定量法を開発し、その方法を用いて、病原性の原虫、糸状菌、及び食用海藻等に6-ガラ系列糖脂質が存在することを見出した。海藻から単離した6-ガラ系列糖脂質の構造解析を行い、その構造を1-phytyl-3-O-[α-D-galactopyranosyl-(1-6)-β-D-galactopyranosyl]- glycerol と同定した。このような構造の糖脂質は初めての報告である。

鞘脂主要存在于质膜微区中，在细胞内信号传导和细胞间相互作用中发挥重要作用。在本研究中，我们研究了申请人发现的非溶酶体鞘脂代谢酶的结构和功能，并取得了以下结果。首先，我们克隆了存在于哺乳动物细胞质中的葡萄糖神经酰胺（GlcCer）降解酶（外切神经酰胺酶）。这种酶是衰老相关蛋白 Klotho (KLrP) 的同源物。我们发现，当该酶的活性受到RNAi抑制时，细胞内GlcCer的量和具有GlcCer骨架的糖脂的量减少，表明KLrP参与细胞糖脂代谢。该酶在大肠杆菌中大量表达，制备了与葡萄糖和半乳糖的共晶，并进行了X射线晶体结构分析。结果表明，KLrP表现出典型的TIM桶状结构，具有8个α螺旋和β链重复，并且位于β链4和7的C端的E165和E373分别充当酸/碱催化残基经证实，这是核残留物。此外，在本研究中，我们首次成功地分析了溶酶体中性神经酰胺酶的晶体结构。该结构是新的，以前从未报道过，并且揭示了催化机制以锌为中心。通过解析结构，我们能够合理地解释这种酶的各种功能，包括它参与鞘脂信号传导以及膳食神经酰胺的代谢和消化。另一方面，我们详细研究了从放线菌中分离的内型糖神经酰胺酶（EGALC）的底物特异性，结果发现该酶特异性作用于6-gala系列糖脂。研究还表明，EGALC 不仅能有效催化水解，还能有效催化糖链转移反应。利用这种特异性，我们开发了6-gala系列糖脂的荧光标记方法和微量定量方法，并利用这些方法将6-gala系列糖脂应用于病原性原生动物、丝状真菌、食用海藻等，发现：它存在。我们分析了从海藻中分离得到的6-吡喃半乳糖基甘油的结构，发现其结构为1-植基-3-O-[α-D-吡喃半乳糖基-(1-6)-β-D-吡喃半乳糖基]-甘油。这是具有这种结构的糖脂的首次报道。

项目成果

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A sensitive and reproducible fluorescent-based HPLC assay to measure the activity of acid as well as neutral β-glucocerebrosidases

一种灵敏且可重复的基于荧光的 HPLC 测定法，用于测量酸性和中性 β-葡萄糖脑苷脂酶的活性

DOI：
发表时间：
2008
期刊：
影响因子：
0
作者：
H. Hayashi; et al.
通讯作者：
et al.

セラミダーゼとグルコセレブロシダーゼの構造と機能

神经酰胺酶和葡萄糖脑苷脂酶的结构和功能

DOI：
发表时间：
2008
期刊：
影响因子：
0
作者：
伊東信
通讯作者：
伊東信

ベーシッスクマスター生化学(糖質の生化学)

基础硕士生物化学（碳水化合物生物化学）

DOI：
发表时间：
2008
期刊：
影响因子：
0
作者：
伊東信 (共著)
通讯作者：
伊東信 (共著)

Mechanistic Insights into the Hydrolysis and Synthesis of Ceramide by Neutral Ceramidase*

中性神经酰胺酶水解和合成神经酰胺的机理见解*

DOI：
10.1074/jbc.m808232200
发表时间：
2009-04-03
期刊：
Journal of Biological Chemistry
影响因子：
4.8
作者：
Tsuyoshi Inoue;N. Okino;Y. Kakuta;A. Hijikata;H. Okano;Hatsumi M. Goda;M. Tani;N. Sueyoshi;K. Kambayashi;H. Matsumura;Y. Kai;Makoto Ito
通讯作者：
Makoto Ito