培養中枢神経細胞におけるaSセリン129リン酸化キナーゼの解析

培养中枢神经细胞中 aS 丝氨酸 129 磷酸化激酶的分析

基本信息

批准号：
07J52144
负责人：
原進
金额：
$ 0.58万
依托单位：
Yamagata University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07J52144/
关键词：
脳神経疾患神経科学

项目摘要

パーキンソン病(PD)は、中年以降に発症する神経変性疾患である。PD全体の90-95%は、明らかな遺伝を示さない孤発性PD(sPD)である。精力的な研究が行われているが、sPDの発症機構の詳細は解明されていない。sPDを病理学的・生化学的に特徴づけるレビー小体(LB)の主要構成成分α-シヌクレイン(αS)は、種々の翻訳後修飾を受ける。LBでは、大部分のαSの129番目のセリン残基がリン酸化されていることが明らかになっている。αSセリン129のリン酸化は、αSの重合化及び細胞毒性の発揮に重要な働きを担っていることが、in vitroとin vivoの解析より示されている。このリン酸化反応を司る候補キナーゼとして、カゼインキナーゼIとII、Gタンパク質共役型受容体キナーゼ(GRK)ファミリーのGRK2とGRK5が知られている。しかし、GRKファミリー分子がとの程度αSセリン129のリン酸化に寄与しているのか不明である。本研究は、種々の細胞で発現が確認されているGRKファミリー(GRK2,3,5,6)に焦点を当て、内因性レベルでこれらキナーゼのαSセリン129リン酸化反応に対する寄与を検討した。方法として、野生型αSを安定的に発現したヒト胎児腎細胞由来のHEK293細胞及びヒト神経芽細胞腫由来のSH-SY5Y細胞において、RNA干渉法を用いてGRKファミリー分子の発現を抑制し、αSセリン129のリン酸化反応の変化の有無を検索した。HEK293細胞において、各GRK分子に対する合成siRNAのトランスフェクションにより、コントロールsiRNAをトランスフェクションした場合に比べ、90%以上の標的分子の発現抑制を認めた。この発現抑制下で、各GRK分子の効果を比べると、αSセリン129のリン酸化反応は、GRK3及びGRK6の発現抑制によって有意な減少を示していた。SH-SY5Y細胞では、siRNAのトランスフェクションによって、各GRK分子は50%以上発現抑制された。この条件において、αSセリン129リン酸化反応は、GRK3、GRK5、さらにGRK6の発現抑制によって有意に減少していた。この結果から、培養細胞間でαSセリン129のリン酸化反応に寄与するGRK分子に違いがあること、神経系培養細胞では、GRK3、GRK5、GRK6が内因性レベルでαSセリン129のリン酸化反応に寄与していることが示唆された。今後、各キナーゼの寄与を明確にすることはsPDの治療標的として神経細胞死を抑制するαSのリン酸化阻害剤の開発に重要な知見を与えると考えられる。本研究成果は、神経科学の国際学会である「Society for Neuroscince2007」で発表した。

帕金森病（PD）是一种中年以后发生的神经退行性疾病。散发性帕金森病 (sPD) 占所有帕金森病病例的 90-95%。尽管正在进行深入的研究，但 sPD 发病机制的细节尚未阐明。 α-突触核蛋白 (αS) 是路易体 (LB) 的主要成分，具有 sPD 的病理和生化特征，会经历各种翻译后修饰。研究表明，LB中αS 129位的丝氨酸残基大部分被磷酸化。体外和体内分析表明，αS 丝氨酸 129 的磷酸化在 αS 聚合和细胞毒性中发挥重要作用。酪蛋白激酶 I 和 II 以及 G 蛋白偶联受体激酶 (GRK) 家族的 GRK2 和 GRK5 被称为控制这种磷酸化反应的候选激酶。然而，尚不清楚 GRK 家族分子在多大程度上对 αS 丝氨酸 129 磷酸化有贡献。本研究重点关注已被证实在多种细胞中表达的GRK家族（GRK2、3、5、6），并在内源水平研究了这些激酶对αS丝氨酸129磷酸化的贡献。作为一种方法，我们使用RNA干扰抑制稳定表达野生型αS的人胚胎肾细胞来源的HEK293细胞和人神经母细胞瘤来源的SH-SY5Y细胞中GRK家族分子的表达，并寻找丝氨酸129的变化磷酸化。在 HEK293 细胞中，与对照 siRNA 转染相比，每种 GRK 分子的合成 siRNA 转染可抑制靶分子表达 90% 以上。比较在此抑制表达下各GRK分子的效果，发现通过抑制GRK3和GRK6的表达，αS丝氨酸129的磷酸化反应显着降低。在SH-SY5Y细胞中，通过siRNA转染，各GRK分子的表达被抑制50%以上。在这些条件下，通过抑制 GRK3、GRK5 甚至 GRK6 的表达，αS 丝氨酸 129 磷酸化显着降低。这些结果表明，在培养的细胞中促进αS丝氨酸129磷酸化的GRK分子存在差异，并且在培养的神经细胞中，GRK3、GRK5和GRK6在内源水平上促进αS丝氨酸129磷酸化。有人建议它做出了贡献。将来，阐明每种激酶的贡献将为开发 αS 磷酸化抑制剂提供重要知识，该抑制剂可抑制神经元细胞死亡，作为 sPD 的治疗靶点。这项研究的结果已在 2007 年神经科学学会国际神经科学会议上发表。