高速AFMによるタンパク質の動態機能解明

使用高速 AFM 阐明蛋白质动力学和功能

基本信息

批准号：
07J09305
负责人：
山下隼人
金额：
$ 1.73万
依托单位：
Kanazawa University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2009
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究は、高速原子間力顕微鏡(高速AFM)を用いて生体膜中における膜タンパク質の動態を高時空間分解能で直接可視化する事で、それらの機能発現過程及び構造変化を捉え、その動態機能を解明する事が目的である。本年度の研究実績を以下に記述する。1.紫膜中でのバクテリオロドプシン(bR)の集合メカニズム及び構造ダイナミクスを明らかにするため、変異体bRを用いた以下の実験を行った。(1)bRが2次元結晶格子に集合する際の構成単位である三量体間での相互作用部位を詳細に明らかにするため、アミノ酸部位特異的変異体bRの作成に取り組んだ。その結果、芳香族残基を持たないアミノ酸に置換した変異体W12Iでは、野生型と比べbRの発現量がかなり低くなる事が分かった。一方、芳香族残基を持つアミノ酸に置換した変異体W12Fでは、野生型と同量の発現に成功し、高速AFM観察により野生型と同じ格子構造を形成する事が分かった。(2)bRの光サイクル時の構造ダイナミクスを明らかにするため、野生型bRと比べて光サイクルが100～1000倍遅い変異体D96Nの高速AFM観察を行い、詳細な動的構造変化を捉える事に成功した。また、その成果を本年度原著論文として報告した。2.脊椎動物視細胞の円盤膜におけるロドプシンとトランスデューシン(Gt)の相互作用を捉えるため以下の実験を行った。円盤膜中で共に拡散するロドプシンとGt分子を区別するため、ロドプシンのみを基盤へ特異的固定化する事に取り組んだ。具体的には、マイカ基盤上にストレプトアビジンの2次元結晶を作成し、ビオチン化したロドプシン抗体を結合させ、その上に円盤膜をのせることで、ロドプシンの固定化を試みた。その結果、ロドプシンC末端抗体を用いた基盤で円盤膜の結合が確認できたが、N末端抗体では、確認できなかった。この事から2重層膜構造である円盤膜の1層化が必要であると考えられる。

该研究利用高速原子力显微镜（高速AFM）以高时空分辨率直接可视化生物膜中膜蛋白的动态，从而捕捉其功能表达和结构变化的过程，目的是阐明。现将今年的研究成果介绍如下。 1.为了阐明细菌视紫红质（bR）在紫色膜中的组装机制和结构动力学，我们利用突变体bR进行了以下实验。 (1)为了详细阐明bR组装成二维晶格时的结构单元三聚体之间的相互作用位点，我们致力于创建bR的氨基酸位点特异性突变体。结果发现，与野生型相比，在氨基酸被不具有芳香族残基的氨基酸取代的突变体W12I中，bR的表达水平显着降低。另一方面，氨基酸被芳香族残基取代的突变体W12F成功表达了与野生型相同的量，高速AFM观察表明，它形成了与野生型相同的晶格结构。。 (2)为了阐明bR在光循环过程中的结构动态，我们对光循环比野生型bR慢100至1000倍的突变体D96N进行高速AFM观察，以捕捉详细的动态结构变化成功了。我们今年还以原始论文的形式报告了结果。 2.进行以下实验以了解脊椎动物感光细胞盘膜中视紫红质和转导蛋白（Gt）之间的相互作用。为了区分在椎间盘膜中一起扩散的视紫红质和 Gt 分子，我们致力于仅将视紫红质专门固定在基底上。具体来说，他们尝试通过在云母基底上创建二维链霉亲和素晶体，结合生物素化的视紫红质抗体，并将圆盘膜放在其顶部来固定视紫红质。结果，使用使用视紫红质C末端抗体的平台确认了盘膜的结合，但使用N末端抗体不能确认。这表明有必要将双层圆盘膜转变为单层。