哺乳類のMATE型有機カチオントランスポーターの構造と機能

哺乳动物MATE型有机阳离子转运蛋白的结构和功能

基本信息

批准号：
07J00772
负责人：
松本拓也
金额：
$ 1.15万
依托单位：
Okayama University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2008
项目状态：
已结题

项目摘要

hMATE1の輸送特性を詳細に解析することが可能な精製・再構成系を構築し、輸送活性を測定した。MATEの典型的な基質であるtotraethyiammonium(TEA)の輸送活性を測定した結果、hMATE1がH+勾配を駆動力とする能動輸送だけでなくH+勾配を必要としない促進拡散も行うことを明らかにした。さらにH+勾配の無い条件においてhMATE1がpH依存性を示すこと、アルカリ側pHにおいて基質に対する親和性が上昇することを明らかにした。この結果はpHの高い細胞質側で基質を捕らえ、pHの低い尿細管側で基質を放出するMATEにとって非常に合理的なメカニズムである。一価のTEAと二価のparaquatの輸送に対する膜電位の影響を謂べることで一価、二価の区別無くカチオンがプロトンと一対一で交換輸送されることを明らかにした。この結果からhMATE1は輸送基質に対する柔軟な識とプロトンとの強固な共役という性質を持つことを明らかにした。精製・再構成系を用いて新たなhMATE1の阻害剤を見いだした。この系はMATEと相互作用を起こす物質をスクリーニングするのに適している。Compound AはMATE特異的な阻害剤であり、非常に低濃度でhMATE1による輸送活性を阻害することができる。この阻害剤はHATEのin vivoにおける輸送のプローブとして使用可能であり、MATEの役割を明らかにしていくうえで有用である。さらにこれらの阻害剤の阻害メカニズムを明らかにするために様々な濃度の阻害剤存在下kineticな解析を行った。compound Aは非競合阻害剤であり、compound Bは競合的阻害剤であることを明らかにした。続いて、HEK293細胞からのTEAの排出をcompound Aが阻害することを示した。この実験はHEK293細胞発現系を用いていったんhMATE1を介して細胞内へと取り込ませたTEAを細胞外pHを6.0に変えることで放出せ、細胞内に残ったTEAの量を測定するというものである。Compound AはhMATE1によるTEAの取り込み、放出を両方阻害するため、hMATE1に結合することで、輸送に伴う構造変化を阻害するものと予想される。hMATE2、2Kも同様に精製、再構成し有機カチオンとH+を交換輸送する性質を持つことを示した。また基質特異性もhMATE1と類似していることを明らかにした。hMATE1、2、2Kの全ての精製、再構成系を構築したことで腎臓における有機カチオン系薬物排出研究の分子基盤を確立できた。

我们构建了一个纯化和重构系统，可以详细分析 hMATE1 的转运特性，并测量转运活性。通过测量 MATE 的典型底物四乙基铵 (TEA) 的转运活性，我们发现 hMATE1 不仅可以进行由 H+ 梯度驱动的主动转运，而且还可以促进不需要 H+ 梯度的扩散。此外，我们发现 hMATE1 在没有 H+ 梯度的情况下表现出 pH 依赖性，并且其对底物的亲和力在碱性 pH 下增加。这一结果表明，MATE 有一种非常合理的机制，可以在 pH 值较高的细胞质侧捕获底物，并在 pH 值较低的肾小管侧释放底物。通过研究膜电位对单价 TEA 和二价百草枯运输的影响，我们阐明了阳离子是通过与质子一对一交换的方式运输的，无论它们是单价还是二价。这些结果表明hMATE1具有对传输底物灵活敏感和与质子强共轭的特性。我们使用纯化和重构系统发现了一种新的 hMATE1 抑制剂。该系统适用于筛选与 MATE 相互作用的物质。化合物 A 是一种 MATE 特异性抑制剂，可以在极低浓度下抑制 hMATE1 介导的转运活性。该抑制剂可用作体内 HATE 转运的探针，并将有助于阐明 MATE 的作用。此外，为了阐明这些抑制剂的抑制机制，在不同浓度的抑制剂存在下进行了动力学分析。结果表明，化合物A是非竞争性抑制剂，化合物B是竞争性抑制剂。接下来，我们发现化合物 A 抑制 HEK293 细胞的 TEA 排泄。在本实验中，使用HEK293细胞表达系统，通过hMATE1将TEA摄入细胞内，并通过将细胞外pH改变为6.0来释放TEA，并测量细胞内残留的TEA的量。由于化合物 A 抑制 hMATE1 对 TEA 的摄取和释放，因此预计通过与 hMATE1 结合，它会抑制与运输相关的结构变化。 hMATE2和2K经过类似的纯化和重构，并显示出具有交换和运输有机阳离子和H+的特性。还发现底物特异性与 hMATE1 相似。通过构建hMATE1、2和2K的所有纯化和重构系统，我们能够为肾脏中有机阳离子药物排泄的研究奠定分子基础。