Epstein-Barrウイルスの複製に伴う宿主細胞応答の解析

与 Epstein-Barr 病毒复制相关的宿主细胞反应分析

基本信息

批准号：
06J01906
负责人：
工藤あゆみ
金额：
$ 2.18万
依托单位：
Aichi Cancer Center Research Institute
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2008
项目状态：
已结题

项目摘要

RPAは3つのサブユニット(RPA1,RPA2,RPA3)から成る蛋白質複合体で、一本鎖DNAに結合する。DNA複製において各段階でRPAは重要な働きを持つ。さらにDNA組み換え修復、遺伝子発現等のDNAを器質とするさまざまな反応に関与する多機能因子であることが知られている。RPA複合体の一つRPA2サブユニットは特に細胞周期信仰やDNA損傷存在かにおいてリン酸化修飾を受けることが知られ、細胞周期制御、DNA損傷応答との関連が報告されている。EBVウイルス複製感染を誘導した細胞では経時的にRPA2のリン酸化修飾が増加し、またRPA2自身およびリン酸化修飾RPA2のDNA結合画分への移行が観察された。さらにリン酸化RPA2はEBウイルス複製領域中に共局在することが免疫染色による観察により明らかとなった。またこのときRPA2と同様にDNA組み換え修復に昨日する因子(Rad51,Rad52,Mre11,Nbs1)もEBウイルス複製領域中での共局在が観察された。免疫沈降実験により、リン酸化RPA2、Mre11,Rad52はEBウイルスDNA複製に関与するウイルス因子BMRF1と共沈してくることがわかり、さらにDNA組み換え修飾に関与する因子群はEBウイルスゲノムを免疫沈降により共沈させることが明らかとなった。またこうしたDNA組み換え修復に関連するタンパク質がEBウイルス複製領域内に観察されるたことは、そこにDNA損傷(DNA二重鎖切断部位)が存在することが強く示唆された。そこでTUNELアッセイを行いDNA二重鎖切断部位の有無を検証したところ、新規DNA合成領域に確かにDNA損傷部位を認めた。またsiRNAを用いてRad51とRPAをdeletionさせるとEBVゲノム合成能に著しい低下がみられた。以上のことから、EBウイルスDNA複製進行中、宿主DNA祖み換え修復関連タンパク質はウイルス複製装置と共に挙動し、そこでウイルスゲノム合成のいずれかのステップに関連してることが示唆された。

RPA 是一种蛋白质复合物，由三个亚基（RPA1、RPA2、RPA3）组成，可与单链 DNA 结合。 RPA 在 DNA 复制的每个阶段都发挥着重要作用。此外，已知它是参与涉及DNA作为器官的各种反应的多功能因子，例如DNA重组修复和基因表达。 RPA2 亚基是 RPA 复合物之一，已知会发生磷酸化，特别是在响应细胞周期控制和 DNA 损伤的存在时，其与细胞周期控制和 DNA 损伤反应的关系已有报道。在受到 EBV 复制感染的细胞中，RPA2 磷酸化随着时间的推移而增加，并且观察到 RPA2 本身和磷酸化的 RPA2 迁移到 DNA 结合部分。此外，免疫染色观察表明磷酸化的RPA2共定位于EB病毒复制区。此时，与RPA2类似，也观察到参与DNA重组修复的因子（Rad51、Rad52、Mre11、Nbs1）共定位于EB病毒复制区域。免疫沉淀实验表明，磷酸化的RPA2、Mre11和Rad52与参与EB病毒DNA复制的病毒因子BMRF1共沉淀。此外，通过免疫沉淀EB病毒基因组检测到参与DNA重组修饰的因子已经变得清楚。共沉淀是可能的。此外，在EB病毒复制区域内观察到与DNA重组修复相关的蛋白质，强烈表明那里存在DNA损伤（DNA双链断裂位点）。因此，当我们进行TUNEL检测来验证DNA双链断裂位点是否存在时，我们发现在新的DNA合成区域确实存在DNA损伤位点。此外，当使用siRNA删除Rad51和RPA时，观察到EBV基因组合成能力显着下降。这些结果表明，在 EB 病毒 DNA 复制过程中，宿主 DNA 重组修复相关蛋白与病毒复制机制一起发挥作用，并参与病毒基因组合成的步骤之一。