試験管内分子進化法による光応答性分子ピンセットの開発

利用体外分子进化方法开发光响应分子镊子

基本信息

批准号：
06F06606
负责人：
伊藤嘉浩
金额：
$ 0.32万
依托单位：
The Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2008
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では、試験管内分子進化法による光応答性分子ピンセットの開発を目指している。アゾベンゼンやスピロピランなどの光応答性分子を側鎖にもつアミノ酸を含むペプチドライブラリーを構築し、その中から特定のタンパク質に対して光応答性を持つペプチド分子を試験管内分子進化法により選択する。光応答性アミノ酸含有ペプチドライブラリーの構築に先立ち、光応答性アミノ酸をペプチド鎖に導入する方法を確立する必要がある。非天然アミノ酸導入の第1段階は直交化tRNAのアミノアシル化であり、これには種々の方法が提案されている。本研究では、これまでと異なる新しいアプローチから、tRNAのアミノアシル化を目指す。アミノ酸担持アデノシンをドナー分子(DNA)から3末端アデノシン欠損tRNA(アクセプター分子)の3末端に転位させることで、tRNAのアミノアシル化を実現する。まずモデル反応系として、tRNAの代わりに15merのRNAを用いて、その転位反応を行った。脱離グループ(ベンゼンスルホン酸残基)を連結したアミノ酸担持アデノシンを結合したDNAをドナー分子として、それに相補的な3'末端リン酸チオエート化したRNAをアクセプター分子として合成した。これらの二本鎖形成により、チオエートの求核攻撃で脱離グループを脱離させるとともに、アミノ酸担持アデノシンをドナー分子からアクセプター分子へ転位させることを目指した。ドナーとアクセプター分子を緩衝液中で35℃、2時間インキュベートさせた後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した。その結果、フェニルアラニン担持アデノシンのドナーからアクセプター分子への有意な転位を確認した。従って、アミノ酸担持アデノシンの核酸分子間転位反応に成功した。今後、アクセプター分子としてアデノシン欠損tRNAを使用し、光応答性アミノ酸によるtRNAのアミノアシル化を行う予定である。

在这项研究中，我们的目标是利用体外分子进化方法开发光响应分子镊子。构建了侧链含有偶氮苯、螺吡喃等光响应性分子的氨基酸的肽库，并利用体外分子进化方法选择对特定蛋白质具有光响应性的肽分子。在构建含有光响应性氨基酸的肽库之前，需要建立一种将光响应性氨基酸引入肽链的方法。引入非天然氨基酸的第一步是正交 tRNA 的氨酰化，为此已经提出了各种方法。在这项研究中，我们的目标是使用一种新方法对 tRNA 进行氨酰化。 tRNA 的氨酰化是通过将携带氨基酸的腺苷从供体分子 (DNA) 易位至 3 末端腺苷缺陷的 tRNA（受体分子）的 3 末端来实现的。首先，作为模型反应系统，我们使用 15mer RNA 代替 tRNA 进行转座反应。使用与离去基团（苯磺酸残基）连接的携带氨基酸的腺苷结合的DNA作为供体分子，并合成互补的3'末端磷酸化硫代RNA作为受体分子。通过形成这些双链，我们的目的是通过硫代酸盐的亲核攻击来分离离去基团，并将氨基酸支持的腺苷从供体分子转移到受体分子。供体和受体分子在 35°C 的缓冲液中孵育 2 小时，然后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。结果，证实了携带苯丙氨酸的腺苷从供体分子到受体分子的显着易位。因此，我们成功地进行了氨基酸支持的腺苷的分子间核酸转座反应。未来，我们计划使用腺苷缺陷的tRNA作为受体分子，并用光响应氨基酸对tRNA进行氨酰化。