アーキア特有の補酵素A生合成機構の全容解明

彻底阐明古细菌特有的辅酶A生物合成机制

基本信息

批准号：
12J02716
负责人：
冨田宏矢
金额：
$ 1.15万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2012
资助国家：
日本
起止时间：
2012 至 2013
项目状态：
已结题

项目摘要

申請書課題2. CoA生合成の制御機構既に解析したThermococcus kodakarensisのketopantoate reductase (KPR)に続き、ketopantoate hydroxymethyltransferase (KPHMT)の解析を行った。その結果、KPHMTはCoAによる阻害を受けなかったことから、本菌のCoA生合成において、KPRは第一の阻害ターゲットであることが明らかとなった。申請書課題3. β-Alanineの生合成CoAの分子骨格の構成成分であるβ-alanineに関し、本菌におけるその生合成機構の解明を進めるため、glutamate decarboxylase (GAD)のホモログ遺伝子であるTKl814の解析を行った。生化学的解析の結果、TK1814はGluのみならずAspに対しても酵素活性を示したが、Aspに対するk_<cat>/K_m値はGluに対する値よりもはるかに大きいことが分かった。このことから、TK1814はADCとして機能することが示唆された。さらに遺伝学的解析を行うため、TK1814遺伝子破壊株を作製し、その生育特性を検証した。その結果、TK1814遺伝子破壊株は明確な生育を示さなかったが、CoAやβ-alanineの添加によってその生育は回復した。一方で、GAD反応の生成物であるγ-aminobutyrateを添加した場合では、生育は全く回復しなかった。この結果より、TKI814はADCとして機能し、β-alanine, CoAの生合成に重要であることが遺伝学的に証明された。以上より、アーキアにおけるβ-alanineの生合成機構を解明し、β-alanineはGADホモログが持つADC活性によってAspから合成されることが明らかとなった。

应用作业2.CoA生物合成的控制机制继之前分析了Thermococcus kodakarensis的酮泛解酸还原酶(KPR)之后，我们分析了酮泛解酸羟甲基转移酶(KPHMT)。结果，KPHMT 不受 CoA 抑制，表明 KPR 是该细菌 CoA 生物合成的主要抑制靶标。应用作业3. β-丙氨酸的生物合成为了阐明CoA分子骨架的组成部分β-丙氨酸的生物合成机制，我们研究了该细菌中谷氨酸脱羧酶同源基因TKl814的生物合成（ GAD）进行了分析。生化分析表明，TK1814不仅对Glu表现出酶活性，而且对Asp也表现出酶活性，但Asp的k_<cat>/K_m值远大于Glu。这表明 TK1814 充当 ADC。为了进一步进行遗传分析，我们创建了 TK1814 基因破坏菌株并验证了其生长特性。结果，TK1814基因破坏的菌株没有表现出明显的生长，但通过添加CoA和β-丙氨酸，其生长得以恢复。另一方面，当添加GAD反应产物γ-氨基丁酸酯时，生长根本没有恢复。这些结果从基因角度证明 TKI814 具有 ADC 功能，对于 β-丙氨酸和 CoA 的生物合成非常重要。由此，我们阐明了古细菌中β-丙氨酸的生物合成机制，并揭示了β-丙氨酸是通过GAD同系物的ADC活性从Asp合成的。