分子認識ポリマー複合型人工アロステリック酵素の開発

分子识别高分子复合型人工变构酶的开发

• 批准号: 11J08237
• 负责人: 大柴 雄平
• 金额: $ 0.83万
• 依托单位: Tokyo Institute of Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2011
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2011 至 2012
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11J08237/
• 关键词: コンジュゲート; ポリエチレングリコール(PEG); P450cam; 遺伝子組み換え酵素; 分子認識; アビジン; CDスペクトル; コンフォメーション変化; コンジュゲート; ポリエチレングリコール(PEG); P450cam; 遺伝子組み換え酵素; 分子認識; アビジン; CDスペクトル; コンフォメーション変化

本研究は、生体内物質の高度な機能から着想を得た、複数の分子認識により複数の反応を制御するダブルコントロール型人工アロステリック酵素を、酵素P450camの遺伝子組み換え体(3mD)と分子認識ポリマーの複合化という汎用性のある手法で開発することを目的とする。昨年度は、分子認識部位にスペーサーを有するビオチン、シグナルにアビジンを選定して、アビジンの認識により酵素活性が変化する、不可逆であるがよりシンプルな系での実証を試みた。すると、アビジンの認識によりタンパク質のコンフォメーション変化を誘起し、ドラスティックな活性低下を引き起こすことが可能であることが証明された。しかし、その活性抑制メカニズムは解明されていない。そこで、本年度は、活性抑制メカニズム解明の第一段階として、分子認識部位であるビオチン化合物のスペーサーを長くすることで、分子認識部位の長さが3ml)の活性に与える影響を評価した。すると、分子認識部位導入後、スペーサーであるpoly(ethylene glycol)(PEG)のユニット数が2の場合は酵素活性が保持されていたが、PEGユニット数が11とさらに長くなると酵素活性は大幅に低下した。これらのビオチン化合物と同等またはより長いPEGを3mDに導入しても酵素活性が大幅に低下したことから、ある長さ以上の分子認識部位を3mDに導入すると酵素活性が抑制されることが分かった。分子認識部位導入後に酵素活性が保持されたPEGユニット数が2のコンジュゲート体では、アビジン認識後酵素活性は低下し、アビジンに対する応答性が確認された。従って、分子認識部位導入後酵素活性を保持し、かつ標的分子認識後活性を低下させるためには、短い分子認識部位が必要であることが分かった。さらに、作製した全ての3mDコンジュゲート体に対して、活性体の割合と活性残存率の相関関係を見ると、多くのコンジュゲート体で活性抑制の原因は不活性体への変化であったが、基質の結合変化も原因となる場合があることが確認された。

这项研究旨在开发一种双控制人工变构酶，该酶通过多功能方法与分子识别的P450CAM结合使用的多功能方法，通过体内物质的先进功能来控制多种反应，灵感来自于体内物质的先进功能。去年，我们选择了生物素，该生物素在分子识别位点具有隔离剂，而avidin作为信号，并试图在不可逆但更简单的系统中证明它，其中酶活性由于识别avidin而变化。已经证明，抗原蛋白的识别可以诱导蛋白质的构象变化，从而导致活性急剧下降。但是，抑制活性的机制尚未澄清。因此，今年，作为阐明活性抑制机制的第一步，我们通过增加生物素化合物的间隔物，即分子识别位点，评估了分子识别位点对3ML的活性的影响。引入分子识别位点后，当间隔聚（乙二醇）（PEG）的单位数量为2时，将保留酶活性，但是当PEG单元的数量更长至11时，酶活性显着降低。由于将相当于或更长时间的PEG引入了比这些生物化合物中的PEG等于3 MD，从而显着降低了酶活性，因此发现将一定长度或更长的分子识别位点或更长的分子识别位点或更长的时间引入3 MD抑制了酶活性。在引入分子识别位点后保留酶活性的许多PEG单元的偶联物中，识别抗生肽后的酶活性降低，并确认对抗生肽的反应性。因此，已经发现，在引入分子识别位点后，需要短的分子识别位点保留酶活性，并在靶分子识别后减少活性。此外，考虑到活性物质的比例与所有3MD共轭物的剩余活性率之间的相关性，可以证实，尽管许多结合物中抑制活性的原因是非活性物质的变化，但底物结合的变化也可能是原因。