分子認識ポリマー複合型人工アロステリック酵素の開発

分子识别高分子复合型人工变构酶的开发

基本信息

批准号：
11J08237
负责人：
大柴雄平
金额：
$ 0.83万
依托单位：
Tokyo Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2011
资助国家：
日本
起止时间：
2011 至 2012
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究は、生体内物質の高度な機能から着想を得た、複数の分子認識により複数の反応を制御するダブルコントロール型人工アロステリック酵素を、酵素P450camの遺伝子組み換え体(3mD)と分子認識ポリマーの複合化という汎用性のある手法で開発することを目的とする。昨年度は、分子認識部位にスペーサーを有するビオチン、シグナルにアビジンを選定して、アビジンの認識により酵素活性が変化する、不可逆であるがよりシンプルな系での実証を試みた。すると、アビジンの認識によりタンパク質のコンフォメーション変化を誘起し、ドラスティックな活性低下を引き起こすことが可能であることが証明された。しかし、その活性抑制メカニズムは解明されていない。そこで、本年度は、活性抑制メカニズム解明の第一段階として、分子認識部位であるビオチン化合物のスペーサーを長くすることで、分子認識部位の長さが3ml)の活性に与える影響を評価した。すると、分子認識部位導入後、スペーサーであるpoly(ethylene glycol)(PEG)のユニット数が2の場合は酵素活性が保持されていたが、PEGユニット数が11とさらに長くなると酵素活性は大幅に低下した。これらのビオチン化合物と同等またはより長いPEGを3mDに導入しても酵素活性が大幅に低下したことから、ある長さ以上の分子認識部位を3mDに導入すると酵素活性が抑制されることが分かった。分子認識部位導入後に酵素活性が保持されたPEGユニット数が2のコンジュゲート体では、アビジン認識後酵素活性は低下し、アビジンに対する応答性が確認された。従って、分子認識部位導入後酵素活性を保持し、かつ標的分子認識後活性を低下させるためには、短い分子認識部位が必要であることが分かった。さらに、作製した全ての3mDコンジュゲート体に対して、活性体の割合と活性残存率の相関関係を見ると、多くのコンジュゲート体で活性抑制の原因は不活性体への変化であったが、基質の結合変化も原因となる場合があることが確認された。

在这项研究中，我们受到生物体内物质高级功能的启发，利用酶 P450cam (3mD) 的转基因形式和分子识别聚合物，开发了一种双控人工变构酶，通过多重分子识别来控制多种反应。目的是使用称为合成的通用方法来开发它。去年，我们选择了分子识别位点上有间隔区的生物素和抗生物素蛋白作为信号，并试图证明一个不可逆但更简单的系统，其中酶活性由于抗生物素蛋白的识别而发生变化。随后证明，亲和素的识别会引起蛋白质的构象变化，导致活性急剧下降。然而，抑制其活性的机制尚未阐明。因此，今年，作为阐明活性抑制机制的第一步，我们评估了延长作为分子识别位点的生物素化合物的间隔基对分子识别位点活性的影响（长度3ml）。引入分子识别位点后，当间隔聚乙二醇(PEG)单元数为2时，酶活性保持不变，但当PEG单元数增加至11时，酶活性显着下降。即使将等于或长于这些生物素化合物的PEG引入到3mD中，酶活性也显着降低，这表明将长于一定长度的分子识别位点引入到3mD中会抑制酶活性。对于具有两个 PEG 单元的缀合物，在引入分子识别位点后保留了酶活性，在亲和素识别后酶活性降低，证实了对亲和素的响应性。因此，发现需要短的分子识别位点，以维持引入分子识别位点后的酶活性并降低目标分子识别后的活性。此外，观察所制备的所有3mD缀合物的活性形式的百分比和残余活性率之间的相关性，发现许多缀合物的活性抑制的原因是非活性形式的变化。底物结合也可能是一个原因。

项目成果

期刊论文数量（0）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

アビジンシグナルによる酵素の活性調節

抗生物素蛋白信号对酶活性的调节

DOI：
发表时间：
2011
期刊：
影响因子：
0
作者：
大野翔太;浦栃信吾;紀ノ岡正博;田谷正仁;大柴雄平・田巻孝敬・大橋秀伯・伊藤大知・平川秀彦・山口哲志・長棟輝行・山口猛央
通讯作者：
大柴雄平・田巻孝敬・大橋秀伯・伊藤大知・平川秀彦・山口哲志・長棟輝行・山口猛央

Control of P450cam Activity with the Avidin Recognition

通过亲和素识别控制 P450cam 活性

DOI：
发表时间：
2012
期刊：
影响因子：
0
作者：
Yuhei Oshiba;Takanori Tamaki;Hidenori Ohashi;Taichi Ito;Hidehiko Hirakawa;Satoshi Yamaguchi;Teruyuki Nagamune;Takeo Yamaguchi
通讯作者：
Takeo Yamaguchi

分子認識による活性制彎型人工酵素の開発

通过分子识别开发活性限制人工酶

DOI：
发表时间：
2012
期刊：
影响因子：
0
作者：
関澤佳太; 前田和彦; 堂免一成; 小池和英; 石谷治;大柴雄平
通讯作者：
大柴雄平

Control of Enzyme Activity by Introduction of Molecular Recognition Moiety

通过引入分子识别部分来控制酶活性

DOI：
发表时间：
2011
期刊：
影响因子：
0
作者：
Yuhei Oshiba;Takanori Tamaki;Hidenori Ohashi;Taichi Ito;Hidehiko Hirakawa;Satoshi Yamaguchi;Teruyuki Nagamune;Takeo Yamaguchi
通讯作者：
Takeo Yamaguchi

分子認識による活性制御型人工酵素の構築

利用分子识别构建活性控制的人工酶

DOI：
发表时间：
2011
期刊：
影响因子：
0
作者：
Yoon;Y-H.;Kawai;F.;Sugiyama;K.;Park;S-Y.;Nihira;T.;Choi;S-U.;Hwang;Y-I.;大柴雄平・田巻孝敬・大橋秀伯・伊藤大知・平川秀彦・山口哲志・長棟輝行・山口猛央
通讯作者：
大柴雄平・田巻孝敬・大橋秀伯・伊藤大知・平川秀彦・山口哲志・長棟輝行・山口猛央